乙型肝炎病毒致肝细胞癌发生机制研究进展

郭恩爽综述，周福元审校

·综述·

乙型肝炎病毒致肝细胞癌发生机制研究进展

郭恩爽综述，周福元审校

肝细胞癌（HCC）的发生与乙型肝炎病毒（HBV）感染密切相关。HBV感染所致的炎症反应、HBV X基因及其产物X蛋白、核心启动子突变、前S2区突变、剪接特异性蛋白等均可能参与HCC的发生发展。

肝细胞癌；乙型肝炎病毒；发生机制

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一。近年来随着分子生物学、流行病学、病毒学、遗传学等的研究进展，普遍认为，HCC的发生是一个有多因素参与多步骤协同的复杂过程，如肝炎病毒感染、长期酗酒、食用黄曲霉毒素污染的食物以及饮用蓝绿藻类毒素污染的水源等[1]，而其中乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的感染扮演着十分重要的角色[2]。不管是HBV感染引起的肝炎肝硬化，还是分子水平的整合突变都与HCC的发生有着比较密切的关系。因此，明确HBV导致HCC的机制对预防、诊断和治疗肝细胞癌具有非常重要的意义。

1 HBV相关性肝硬化与HCC

肝硬化是HBV相关性HCC发生的主要危险因素，肝硬化患者5年内有15%～20%的患者是以HCC为第一死亡原因的。肝硬化引起HCC的进程主要是由炎症反应所介导的。炎症反应导致肝细胞死亡和再生过程重复进行，使肝细胞增殖的循环率大大增加，肝细胞周期进程加快的持续刺激，最终超出宿主肝细胞DNA的适应能力，引起基因突变，宿主基因中一些关键的变异的累积，最终导致肝细胞转化为恶性克隆。在炎性肝脏组织中存在的单核细胞可在局部产生活性氧，这种活性氧也可促进肝细胞的恶性转化。同时肝纤维化破坏了肝脏正常的框架结构，细胞与细胞间的交互作用加剧，最终导致肝细胞的生长失控[3]。总之，乙型肝炎肝硬化所涉及的持续炎性变将通过多步骤的综合程序促使HCC的发生。

2 HBV X蛋白（hepatitis B virus x protein,HBX）与HCC

HBV可通过多种途径引起HCC的发生。HBV可通过与人体染色体整合，诱导正常染色体发生缺失、突变，导致染色体不稳定，从而引起肝细胞癌变[4]；HBV可激活原癌基因，诱导抑癌基因发生基因突变，从而促进癌变的发生；另外，HBV基因X区所编码的HBx也在HCC的癌变过程中发挥着极其重要的作用[5]。

HBV X区是HBV结构和功能上重叠最多的区段，X基因位于核苷酸1374～1836，是HBV DNA开放阅读框中最小的基因，所编码的HBX约含154个氨基酸，分子量约17 kDa，全长的HBX由N-端1/3负调节区和C-端2/3反式激活或共激活区两个功能区构成。HBX本身无DNA结合活性，而是通过活化一些反式作用因子，使其结合于自身的或异源的启动子或增强子上，发挥其转录水平的反式调控作用。

在大部分HCC中可见HBV DNA的整合常发生于HBV DNA链末端的两个直接重复序列（direct repeats，DR），而X基因紧邻DR序列，因此整合也常发生于X基因及其附近。X基因可能通过整合使P16基因序列变异，引起P16基因表达缺陷，导致其G1～S期滞留和抗增生效应丧失[6]。X基因可能通过整合直接激活原癌基因、抑制抑癌基因的表达而参与HCC的发生。整合的HBV DNA序列X基因常出现多种序列变异，包括核苷酸的缺失和点突变等。其中以X基因3'端核苷酸的缺失最常见，130位和131位密码子突变次之。X基因3'端核苷酸的缺失，导致HBX出现C端的缺失。研究发现，C端缺失的HBX失去全长HBX对细胞增生和转化的抑制作用，并促进细胞周期进程在HCC形成中起重要作用[7-10]。整合的X基因130和131位的双突变位点接近X基因上反式激活功能至关重要的区域，可能这种双突变通过影响HBX的反式激活功能，在致癌过程中起重要作用[11]。

2.1 HBX的反式激活作用HBX具有反式激活作用，该反式激活作用广泛存在于细胞复制、炎症反应、免疫反应相关的众多信号传导通路及基因活动中，影响宿主细胞的基因转录途径、细胞凋亡、细胞周期进程、蛋白质的降解、遗传稳定等因素[12-14]；在由HBV诱发HCC的发生、发展及转移过程中发挥直接且重要的作用。HBX可反式激活许多细胞内启动子和增强子及其结合位点，如激活核因子（nuclear factor-kappa，NF-κB），激活蛋白（activatorproteins，AP），CCAAF增强子结合蛋白（enhancer binding protein，CEBP），活化转录因子/cAMP反应元件结合蛋白（activating transcription factor/cAMP response element binding protein，ATF/ CREB），RNA聚合酶，活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NF-AT），及与细胞增殖基因有关的细胞内启动子如IL-8、TNF、转化生长因子β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）或刺激细胞内参与调控机制的蛋白激酶级联反应增加[15]，如活化酪氨酸激酶、激活丝裂酶原活化蛋白激酶、磷酸肌酸激酶、胞外信号调节激酶等[16-18]，以及影响细胞信号传导通路的活性[19]，如HBX可激活Wnt/β-catenin信号传导通路。Wnt/β-catenin信号传导通路参与调控胚胎正常发育和成人组织中细胞增殖分化，其中β-catenin是细胞内黏附和Wnt信号传导通路的一个重要因子，正常组织中βcatenin分布在细胞膜上，而在肿瘤组织中的β-catenin在胞质和/或胞核中聚集。丁浩等[20]通过Ad-HBx以转染L02细胞系的研究显示，HBX可使β-catenin在细胞质和细胞核内大量聚集，从而激活Wnt/β-catenin信号传导通路，细胞核内的β-catenin与T细胞因子结合形成复合物，激活下游靶基因的转录，引起细胞增殖和分化失控。HBX也可通过活化DNA甲基转移酶使E-cadherin增强子甲基化而抑制E-cadherin的转录，从而激活Wnt信号传导通路[21]。

2.2 HBX对细胞周期和细胞凋亡的影响HBX可通过对cyclins、cyclin依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinase，CDK）和cyclin依赖性蛋白激酶抑制剂（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI）的活性及细胞周期校验点的调节影响细胞周期进程，参与对细胞周期的调节。研究发现，HBX促进转化的肝细胞中cyclinD1、A和B1及CDK2的活化，促进了G1、S和G2/M进程；而对非转化的肝细胞，HBX促进细胞进入G1和S期，接着出现S期暂停，并诱导CDKI-p21cip1表达，抑制CDK2的活性，但HBX通过下调G2/M校验点使细胞并不停滞于G2/M期，促进细胞周期进程。

在转基因小鼠模型中发现，HBX可通过激活NF-κB抑制凋亡，抑制NF-κB的活性激活凋亡程序[22]，抑制凋亡利于肝细胞的无限增生，而激活凋亡则利于HBV的复制和扩散，均可促进HCC的发生。

2.3 HBX诱发中心体异常的致癌作用HBX可能通过结合HBX交互蛋白（HBX interacting protein，HBXIP）[23]或是与NF-κB从核内运输到核外的核输出受体-Crm1结合，使Crm1在胞质滞留，NF-κB滞留于胞核，引多极纺锤体的形成，使染色体分离缺陷，造成中心体异常增多，从而影响肝细胞的有丝分裂，可能参与HCC的发生。

2.4 HBX抑制损伤DNA的修复Martin et al[24]发现，HBX可与损伤DNA结合蛋白（damage specific DNA binding protein，DDB）的两个亚基DDB1和DDB2结合形成HBX-DDB1-DDB2复合物干扰DDB1-DDB2复合物的形成，及与损伤DNA的结合而干扰损伤DNA的修复，可导致DNA损伤累积，遗传信息不稳定而使细胞发生恶性转化。

2.5 HBX与HCC的转移Ou et al[25]通过实验发现HBX可通过上调膜型基质金属蛋白酶1（membrane type-1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）的表达，使肿瘤细胞的转移能力增强。表达上调的MT1-MMP则可进一步激活细胞表面的MMP-2，另外，HBX还通过NF-AT依赖的方式激活环氧酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）基因启动子，促进COX-2的表达，COX-2对MT1-MMP的表达和MMP-2的激活产生正调节作用，MT1-MMP，MMP-2和COX-2通过,研究显示[26，27]，在缺氧条件下，转染X基因的肿瘤组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达较未转染者明显增高，肿瘤组织的生长速度增快。VEGF是新生血管形成的中心调控因子，为缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的重要靶基因。HBX可通过有丝分裂原活化激酶途径增加HIF-1的转录活性和稳定性而减少其降解，从而增强HIF-1对VEGF转录的诱导作用，使VEGF表达增多，诱导肿瘤组织中新生血管形成，为肿瘤组织提供氧和营养物质，且增加肿瘤或炎症的局部血流，以利于肿瘤迅速生长和转移。

3 HBV核心启动子（core promoter，CP）突变与HCC

CP区与HBV X基因的C端编码序列相重叠，故CP区的突变可改变重叠区X基因的编码序列，可能会改变HBX的生物功能，这些结构域的突变不仅涉及控制病毒复制的调节元件，而且潜在增强它们的转录能力，增加HCC的危险度。

CP区常见的突变位点为1762位的A突变为T和1764位的G突变为A，这种双突变与前C/C区的mRNA减少有一定的关联，会导致HBeAg水平显著下降和病毒复制能力明显增强[3]。也有临床研究发现双突变可能会出现于HCC发生的早期阶段，与较高的血清HBV DNA水平关系不甚密切，而其它位点的突变如1753位点的T突变为C/A/G，1768位点的T突变为A，可能出现于HCC发生的较晚期阶段，与HCC的进展关系密切，并且这些位点的联合突变发生HCC的危险性更高[28]。

CP突变能够上调S期激酶相关蛋白（Sphase Kinaseassociated Protein 2，SKP2），SKP2是多重促有丝分裂级联反应的的下游效应因子，这些级联反应包括AKT，络氨酸激酶/信号转导和转录激活因子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）和Wnt/βcatenin等，可参与HCC的发生。SKP2的上调能够促使肝细胞恶性变和肿瘤进展，并且SKP2可通过SKP2依赖性泛素蛋白酶体通路下调P21的表达，P21具有抑制S期进行促使细胞滞留和调节细胞凋亡的生物活性，是细胞周期蛋白依赖性激酶复合体的抑制因子，也是一些新的HCC相关性蛋白的下游调节因子，可在较强的抗癌反应中起作用[29]，P21的下调将加快S期进程，增强DNA的复制和细胞增殖能力，增加发生HCC的风险。

4 HBV前S2区突变与HCC

Mun et al[30]通过稳定的肝细胞系试验发现，HBV前S2区的F141L突变能够通过诱导细胞增殖和转化对HCC的发生发展产生重大影响。HBV前S2区的F141L突变可能上调增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和CDK4，二者可促进细胞增殖。HBV前S2区T141L突变可能抑制P53-P21轴的表达，P53起肿瘤抑制因子作用，参与多方面的细胞进程，包括抑制转化细胞的增殖、抑制致癌转化、调节细胞周期的阻滞和凋亡等，P21可被P53所诱导，致癌物质或辐射等因素导致DNA损伤时，P53被活化同时诱导P21转录，二者发生协同作用，P53-P21轴的表达被抑制将破坏细胞周期在G1/S阶段的控制位点，使维持基因组稳定性的突变累积，从而促进HCC的发展。

也有研究发现，HCC患者HBV前S2区存在大量的缺失突变，而无症状携带者的前S2基因并无大量的缺失突变发生，提示HCC患者HBV前S2基因为高度变异区，而前S2区缺失突变则可能与HCC的发生密切相关[31]。前S2基因的缺失突变大多是由真核细胞mRNA剪接机制，以及HBV DNA聚合酶所具有的逆转录酶活性参与DNA模板转换机制等造成的部分缺失突变，HBV前S2缺失突变可通过P27（kip1）的降解而导致DNA损伤，可通过CDK2途径导致视网膜母细胞瘤抑制基因过磷酸化[32]，可抑制P53而导致HCC发生。缺失的前S2蛋白可激活有丝分裂酶原活化蛋白激酶信号通路，导致发生c-Raf-1/MEK/ERK信号传导级联反应，从而增强细胞增殖引起的恶性转化。

5 乙型肝炎病毒剪接蛋白（hepatitis B virus splice-generated protein，HBSP）与HCC

HBV基因组剪接变异体是由HBV前基因组RNA经剪接并逆转录产生的，长度为2.2kb的剪接变异体占80%以上，可编码剪接特异性蛋白HBSP。HBSP已经在慢性活动性肝炎患者的活检标本中发现，该蛋白的抗体也已经在大约50%的慢性乙型肝炎患者的血清中发现。体外试验发现HBSP的表达能够诱导细胞凋亡，并可能通过调节TGF-β依赖性信号通路影响肝细胞的稳定性，可能是HBV诱发肝纤维化的新机制。在HBSP的N端部分发现了BH3共同区域，该区可能通过Bcl-2/Bcl-xl相互作用影响肝细胞凋亡。慢性乙型肝炎患者体内T细胞抵抗HBSP的免疫反应可能直接参与导致HCC发生的多个环节[33]。HBSP还可以促进多环芳香烃的代谢，加速了致癌物的致癌作用。

6 隐性HBV感染与HCC

隐性HBV感染持续存在是肝细胞克隆扩增和HCC发展的重要危险因子的观点已被广泛接受，这种关联已被流行病学和分子学所提出，也已得到动物模型分析结果的支持，在HBsAg隐形的HCC患者中检测到HBV基因组的概率已从30%提高到80%左右。在土拨鼠肝癌模型中，17%被WHV感染的动物已发展为原发性肝癌，尽管其血清中WHV表面抗原是阴性的；在血清反应完全阴性的地松鼠肝癌组织中肝炎病毒DNA序列也已被识别[34]。因此，暗示HBsAg阴性的HCC患者体内存在HBV的隐性持续感染，隐性HBV仍具有与肝细胞转化有关的致癌特性。隐性HBV变种在前S/S、前C/C、X基因等区和调节元件（核心启动子、增强子Ⅰ和Ⅱ）具有异质性，可能参与病毒复制和/或基因表达，然而点突变或缺失，一种特定的基因型或变化模式能否预测致癌转化仍有待确定[35]。

7 结语

HBV感染是HCC发生发展的重要原因，其致癌机制取得了较大进展，但仍不十分明确，仍需进一步探讨；HCC的发生发展是一个多因素参与的复杂过程，包括HBV感染在内的各种病原学因素和功能因子及环境因素均可能参与其中，我们在分析HBV感染的同时也应考虑其它因素如HCV感染、黄曲霉毒素等的相关致癌作用，它们可能是引发了不同的癌变信号通路，也可能是协同作用于某一相关机制，这也待进一步研究；并且肝细胞癌变是一个动态过程，我们还应对HBV不同阶段的肝脏组织样本进行研究分析。只有深入了解HCC相关的作用机制，才有可能为HCC的治疗提供新的靶点，才有可能为HCC的诊断及治疗提供新的方案。

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（收稿：2013-12-05）

（校对：张骏飞）

Hepatitis B virus-associated mechanisms of hepatocellular carcinoma

GuoEnshuang,Zhou Fuyuan.Department of Infec-tious Diseases，Nanfang Hospital，Affiliated to Southern Medical University，Guangzhou 510515 China

The infection of hepatitis B virus（HBV）plays an important role in the occurrence of hepatocellular carcinoma（HCC）.Multiple factors may be involved in the hepatocarcinogenesis of HBV-related HCC，such as inflammatory response，HBV X gene and its protein，the mutation of HBV core promoter and pre-S 2 genes，HBV spliced protein and so on.We will discuss some progresses in this field.

Hepatocellular carcinoma；Hepatitis B virus；Mechanisms

510515广州市南方医科大学南方医院感染内科

郭恩爽,女，25岁，硕士研究生。研究方向：肝细胞癌发生机制研究。E-mail:ksnfykd@163.com

周福元，E-mail:fuyuan@fimmu.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.04.031