骨髓间充质干细胞对糖尿病视网膜病变大鼠血糖及视网膜功能影响

利焕廉　周金文　蔡晓华

[摘 要] 目的：探讨尾静脉注射骨髓间充质干细胞对糖尿病视网膜病变大鼠血糖及视网膜功能的影响。方法：48只健康大鼠随机选取10只为正常对照组，38只建立糖尿病视网膜病变大鼠模型后，20只采用尾静脉注射间充质干细胞，18只注射等量安慰剂。观察间充质干细胞在肝、脾、肾、胰腺和眼球的分布以及在视网膜的分化特点，监测注射后1、2、3、4wk血糖变化，观察血-视网膜屏障破坏修复情况。结果：BMSCS在肝、脾、肾、胰腺、肺等组织中均有分布，视网膜外核层可见到大量密集的BMSCs重叠存在。实验组大鼠的血糖水平均随干预时间延长逐渐下降，注射后第1 wk血糖差异即有统计学意义。EB渗漏量较基线明显减少。结论： BMSCs可降低糖尿病视网膜病变大鼠血糖，使血-视网膜屏障得到一定程度修复。

[关键词] 糖尿病视网膜病变；间充质干细胞； 血糖；血-视网膜屏障

中图分类号：R774 文献标识码：B 文章编号：2055-5200（2014）02-031-04

前 言

糖尿病的眼部并发症包括糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy， DR）、白内障、暂时性屈光不正以及出血性青光眼，其中DR作为全世界导致视力缺损和失明的第二大因素，在研究糖尿病眼部并发症中有重要意义[1]。DR主要临床表现可分为视网膜缺血缺氧与血管通透性增加两类。视网膜缺血缺氧[2]又可分为棉絮斑、微血管瘤、新生血管、出血、静脉管径变化、视网膜内微血管异常、增殖膜形成。血管通透性增加主要包括渗出与出血。近几年我国经济水平增长，糖尿病患者明显增多。DR会直接导致视网膜的神经细胞、小胶质细胞及胶质细胞等发生病理性改变。视网膜胶质细胞的改变会引起微血管病变，微血管病变又会加重视网膜细胞损伤的程度，两者相互作用从而形成恶性循环。静脉和玻璃体腔注射的骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells， BMSCs）可分化为视网膜及血管内皮细胞以稳定新生血管，进而避免发生出血和渗出症状[3]。本文通过建立糖尿病视网膜病变大鼠模型，探究骨髓间充质干细胞对DR大鼠血糖及视网膜功能的影响，观察视网膜中BMSCs表达，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验资料

1.1.1 模型建立及分组 本次实验进行相关部门审批合格后开展，所有的动物试验过程均遵循动物试验规范。实验所需50只健康的雄性5-7wkWistar大鼠由深圳市人民医院动物实验室提供。50只大鼠，体重180g至220g，抽取10只作为正常对照组（A组），其余40只对大鼠进行12 h空腹饲养，之后按60 mg/kg剂量进行腹腔注射2%链脉佐霉素（STZ），1 wk后动物血糖水平>16.65mmol/L，尿糖超过3+，糖尿病大鼠模型建立；2只死亡，38只建模成功，模型建立后对大鼠进行观察，10wk后，抽取DM大鼠及正常大鼠各2只进行视网膜铺片观察，比较观察正常大鼠和DM大鼠微血管形态变化，确定DM大鼠已患有早期DR。

以随机数字表法将DR大鼠分为2组，B组20只为尾静脉注射BMSCs组，C组18只为DR对照组注射安慰剂。将大鼠固定在鼠盒内，酒精棉球消毒尾部，1mL注射器抽取0.5mL浓度为1×107BMSCs，匀速推入。对照组予以等量安慰剂尾静脉注射。

1.1.2 主要试剂 链脉佐霉素（STZ）、伊文斯蓝（EB）、戊巴比妥钠（美国sigma公司）；柠檬酸钠、甲酞胺、40%福尔马林与柠檬酸（北京化学试剂公司）； 0.9%生理盐水（北京双鹤药业公司）；小鼠抗人核单克隆抗体、小鼠抗Rhodopsin单克隆抗体（美国Chemieon公司）；小鼠抗vWF单克隆抗体、小鼠抗CDgO单克隆抗体（美国AbDSeretee公司）；罗丹明标记山羊抗小鼠Ig抗体、5%羊血清原液（中杉金桥生物技术公司）；PBS粉剂（pH7.2-7.4）（北京中杉金桥生物技术公司）；TritonX-100（美国eBioscienee公司）。

1.1.3 仪器设备 血糖仪、血糖试纸（德国Roche公司）；Syllefgy4酶标仪（美国Bioteek公司）；CO2培养箱（美国NBS公司）；尿糖试纸（广州珠江生化试剂有限公司）；D70显微数字成像系统（日本Olympus公司）； SDEI烘箱（重庆四达实验仪器有限公司）；动静脉导管、lmL、5mL注射器等均为国产。

1.2 实验方法

1.2.1 分离培养BMSCs [5] Wistar大鼠（出生5天）进行颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出股骨、胫骨及肱骨。以无菌注射器穿刺抽取骨髓5mL，抽取等量含10%FBS之培养基，将骨髓冲出至一个10mL无菌离心管中，混匀后1500转/分离心5min，弃上清，用L-DMEM重悬细胞，然后过滤成单细胞，置于37°、5%CO2恒温细胞培养箱进行静置培养。

1.2.2 组织学处理[6] 大鼠用过量麻醉的方法处死，将其胸腔剖开以暴露心脏，心内灌注25mlL4%多聚甲醛后立即摘除大鼠双眼眼球，同时取大鼠部分肝、脾、肾、胰腺、肺组织，并将各组织24h浸泡于10%中性甲醛中，后经常规脱水，透明浸腊包埋进行染色及免疫组织化学染色，显微镜下观察。

1.2.3 EB渗漏测定血-视网膜屏障（BRB）功能 10%水合氯醛液0.4mL/kg，腹腔注射麻醉。暴露右颈静脉，EB45mL/kg由静脉缓慢注入，观察眼球、尾巴及四肢变为蓝色即认为注射成功。注射后循环120min，之后打开动物胸腔，将预热至37℃的柠檬酸缓冲液稀释的1%多聚甲醛由左心室灌注，灌注压为120mmHg（66mL/min），灌注后，立即摘取眼球，断颈处死动物。分离视网膜，4°C过夜晾干后称干重。将视网膜与150mL甲酰胺在70℃下孵育8 h。然后将提取液移入超滤离心管，离心机4℃6000 r/min高速离心90min。取上清液120mL用酶标仪测其吸光度值，测定620nm和740nm2种波长样品的吸光度值之差（净吸光度值），建立EB染料浓度在甲酸胺中的标准曲线。每一样品测量3次.取其平均值。计算各标本中EB浓度，定量计算BRB损伤渗漏情况。

1.2.4 观察指标 记录基线及尾静脉注射后第1、2、3、4wk血糖值。观察BMSCs在大鼠全身分布情况与其在大鼠视网膜局部的分布。各组伊凡斯蓝渗漏量。

1.3 数据与图像处理

利用SPSS 17.0对数据进行统计，数据采用x±s表示，计量资料采用多组间秩和检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。图像利用Olympus Image-pro Discovery图像处理软件进行处理。

2 结果

2.1 BMSCs在全身脏器的分布

尾静脉注射BMSCs组，注射后第1wk即可发现BMSCS在肝、脾、肾、胰腺、肺等组织中均有分布。角膜及胰腺的部分胰管、胰泡中同样存在BMSCs。图1为BMSCs在肾脏和胰腺中分布图。

2.2 BMSCs在视网膜局部的分布

如图2所示，尾静脉注射BMSCs组视网膜外核层可见到大量密集的BMSCs重叠存在着，BMSCs却很少出现在其视网膜内层及节细胞层。

图2 BMSCs在视网膜的分布

A： 视网膜外核层中的BMSCs分布，B：视网膜内层的BMSCs分布，C：节细胞层的BMSCs分布

2.3 BMSCs对血糖的影响

A组（健康对照组）大鼠血糖与B组（尾静脉注射BMSCs组）C组（尾静脉注射安慰剂组）基线血糖差异显著。BC两组大鼠血糖不存在显著性差异。注射干预血糖水平随着干预时间的延长呈逐渐下降的趋势，初始下降较快，1wk后B组血糖与基线值和C组存在显著性差异。4wk后B组血糖未下降到健康对照组水平。具体数据如表1所示。

BMSCs干预对糖尿病大鼠血糖的影响（x±s，mol/L）

时间 正常对照组

（n=10） 注射BMSCs组

（n=20） 注射安慰剂组

（n=18）

基线 7.0±1.7 23.7±3.9 22.1±2.9

第1wk 6.3±1.8 18.4±2.1* 24.1±3.7

第2wk 7.3±0.9 15.7±2.2# 23.5±2.6

第3wk 6.5±1.4 13.5±3.1 23.0±2.8

第4wk 6.6±1.2 12.6±3.3 22.5±3.1

注：与注射安慰剂组比较 *p<0.05，#p<0.01

2.4 BMSCs对BRB功能影响

DR模型组基线水平EB渗漏量与正常对照组间差异具有显著统计学意义。B组注射前基线水平EB渗漏量为19.2±3.1（mL/g.h），注射BMSCs后渗漏量下降为8.6±1.7（mL/g.h），P<0.05，差异具有统计学意义。C组注射前后差异无统计学意义。

3 讨论

糖尿病视网膜病变是一种可引起局部视网膜缺氧、血管通透性增加的微血管病变，严重影响患者的生活[7]。糖尿病在中国发病率已经高达9.7%，患病人口接近1亿。随着我国糖尿病人的增多，糖尿病视网膜病变患者致盲也呈上升趋势，糖代谢紊乱是DM患者发生DR的根本原因，DR的发展是一个缓慢的过程。相关研究资料表明，50%以上的糖尿病患者在患病5-10年后会发生视网膜病变，15年后则高达75%-80%。

DR早期病理基础是BRB破坏。BRB由外屏障和内屏障两部分组成。外屏障由视网膜色素、上皮细胞间紧密连接和包含大量细胞桥粒的闭锁小带构成。内屏障主要由内皮细胞、内皮细胞间的紧密连接及周细胞构成，血管旁的神经胶质细胞（星形细胞和Muller细胞）对其起支撑作用，内皮细胞、周细胞、星型胶质细胞间的相互作用可以使内皮细胞间的紧密连接加强。BRB损伤表现为其通透性增加和紧密连接蛋白变化。Kim等[8]发现DM大鼠视网膜紧密连接蛋白occludin、zo-1明显低于对照组。

BMSCs是成体干细胞中的研究较活跃的一种，体内体外实验己证实其具有向心肌细胞、肝细胞、神经细胞和血管内皮细胞等其它组织分化的能力。在眼底研究方面，2002年Otani等[9]和Tomita等[10]发现经静脉和玻璃体腔注射的干细胞可分化为视网膜及血管内皮细胞，并推测干细胞可能能够稳定新生血管，从而阻止出血和渗出的发生。本实验结果显示尾静脉注射BMSCs后，其在肝、脾、肾、胰腺、肺等组织中均有分布，视网膜外核层可见到大量密集的BMSCs重叠存在。说明全身性静脉干预的干细胞能够通过BRB，在目标组织中达到有效的数量以起到治疗作用。BRB在DR早期就会出现损伤，尾静脉注射方式可使BMSCs到达视网膜，部分修复了DR引起的BRB功能损伤。BMSCs对视网膜血管的修复作用机制可能与分化形成的小胶质细胞的功能有关[11]。MSCs能够在存在视网膜变性病变的小鼠和大鼠模型中表现出视网膜胶质细胞和光感受器细胞的形态和功能，延长自体光感受器细胞的存活时间[12-13]。

BMSCs诱导下干预组血糖下降约54%，可BMSCs有显著降低血糖的功效。根据4wk血糖测定的结果可知，对血糖的干预主要是在2wk内完成的。其机理可能是BMSCs可以诱导胰岛素、胰高血糖素和生长抑素表达。

大鼠尾静脉注射BMSCs可以在视网膜目标组织达到一定数量，部分修复DR引起的视网膜功能损伤，并在胰腺肝肾等多器官分布，降低糖尿病患者血糖。

参 考 文 献

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