利用微生物技术生产肌苷酸和鸟苷酸的进展

王美玲

(青岛科技大学，山东青岛 266042)

1 IMP和GMP的作用

1.1 生理机能

核苷酸是细胞生理机能中必不可少的生物元素，因为它们是DNA和RNA的结构组成部分，是能量载体(即ATP和GTP)、辅酶因子(即NAD+和NADP+)和一些维生素(维生素B1、B2和B9)的结构成分。嘌呤营养不足和核苷酸代谢的紊乱会导致严重的疾病［1］。

IMP是生物合成嘌呤的核心分子，它的生物合成是受到严格调控的。GMP既可以经IMP从头合成，又可以经补救途径合成，而且它是二磷酸鸟苷酸(GDP)、三磷酸鸟苷酸(GTP)、鸟苷四磷酸(ppGpp)和环鸟苷酸(cGMP)的前体分子，他们在生物体中的重要性是众所周知的［2］。此外，这些嘌呤核苷酸可用作食品添加剂，在生物技术产业中具有重大经济利益。

1.2 营养和保护作用

IMP和GMP是天然鲜味的来源，可以用作食品中的风味添加剂，通常和谷氨酸盐一起用于增强食品鲜味［3］。除了内在调味功能，IMP和GMP作为食品添加剂的营养功能也已经得到了相关报道。IMP和GMP既可以改善一些无味食物的适口性，也可以改善低盐食物的可接受性，有利于缓解老年人由于味觉丧失而导致的营养缺乏状况，有利于蛋白质、必要的维生素和矿物质的摄入［4］。因此，它们在应用生物技术领域引起了广泛的兴趣。

有报道称IMP能够刺激成人中枢神经系统轴突的生长，具有保护神经、强心剂和免疫调节的作用［5］;而GMP能发挥神经营养和促神经生长的效果，这对于神经的生长非常重要［6］;此外，一些核苷衍生物是强有力的抗病毒药物，已经被提议作为化疗药物［7］。最后，有报告称IMP和GMP都具有抗氧化活性，因此，可以保护细胞免受活性氧自由基的侵害［8］。

2 IMP和GMP的生物合成及调节

IMP和GMP都是嘌呤合成途径的代谢产物。它们的生物合成方式有两种:既可以通过从头合成途径由5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)和谷氨酰胺获得，另外，嘌呤碱基也可以通过补救途径直接转化为核苷—磷酸衍生物［9］。同时，由于IMP和GMP可以保持细胞内稳态和进行能源供应，在细胞生理中占据关键角色，其合成途径是一个受到严格调控的过程。

2.1 从头合成途径

从头合成途径把谷氨酰胺和PRPP经由10个不同的酶催化过程转化为IMP。IMP是嘌呤代谢途径的中心物质，在随后的两个酶催化过程中它可以被相应的酶催化为 AMP或 GMP［10］。IMP先后被AMP合成酶和AMP裂解酶催化生成AMP。在嘌呤代谢的另一途径中，IMP脱氢酶将IMP转化为黄嘌呤核苷酸(XMP)，然后GMP合成酶将XMP催化为GMP［11］。

2.2 补救合成途径

在补救途径中，PRPP可以被某些特定的磷酸核糖转移酶催化为自由碱基，进行碱基的循环利用。补救途径中的酶催化途径如下:腺嘌呤磷酸核糖转移酶，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，黄嘌呤磷酸核糖转移酶和鸟嘌呤磷酸核糖转移酶分别催化腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤生成 AMP、IMP、XMP和GMP［12］。此外，一些碱基和核苷酸可以被特定的氧化酶类和脱氨酶所催化。例如腺苷酸脱氨酶把AMP催化为 IMP，GMP还原酶把 GMP催化为IMP［13］等。

2.3 合成过程的调节

在真核生物中，大多数与IMP和GMP合成相关的基因都受到细胞外嘌呤的负调控，同时代谢水平的调控也通过终产物反馈调节方式存在于嘌呤代谢途径中［14］。例如PRPP酰胺转移酶被IMP所抑制，并且受到转录水平和代谢水平的双重调节［15］;IMP脱氢酶则被GMP抑制，而与GMP合成有关的基因是受到鸟嘌呤反应元素(GRE)的特别调控，其可以被GDP或GDP衍生物所抑制［16］。

在一些微生物如大肠杆菌(E.Coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，与IMP和GMP生物合成相关基因大部分是以Pur操纵子的形式存在的，PurR基因是Pur操纵子的主要调节基因［17］。当IMP或GMP从环境中可以获得时，可以增强PurR基因抑制目标基因表达的作用效果［18］。作用于PurR基因表达的效应物在不同物种间是不同的，而且在E.coli和B.subtilis中PurR阻遏物的功能也有一些差异［19］。另外，据有关文献报道，B.subtilis中 Pur操纵子的表达也受到一种鸟苷敏感型的核糖开关的调控，它可以负调控操纵子中结构基因的表达［20］。

3 微生物菌种

所有微生物都能够合成嘌呤(IMP和GMP)，而且其产率随着菌种的不同变化很大［21］。因此，要定义一个“嘌呤核苷酸生产微生物”不仅要看微生物合成IMP或GMP的能力，更重要的是评估其把产物分泌到外界培养基中的能力。对于所谓的“嘌呤核苷酸生产微生物”，可以根据有关于嘌呤代谢通路的遗传学和代谢知识，通过随机诱变或代谢工程等方法大幅度的提高其产物产率。

枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(C.Glutamicum)和产氨棒杆菌(C.Ammoniagens)是传统认识上具有最高产量的潜力菌种［22］。这些微生物能够在培养基中积累大量的肌苷酸和鸟苷酸，从而避免复杂的和昂贵的回收提取。其他微生物也被用于生产GMP和IMP:例如可以利用链霉菌(Streptomycetes)菌种生产GMP，利用索多斯微球菌(Micrococcus sodonensis)和柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)生产IMP［24］;最近也开始利用解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生产核苷酸，并且其产量可能与B.subtilis相当;E.coli作为一种模式生物，由于其基因组信息和基因组工具较多，也被认为是潜在的嘌呤核苷酸生产微生物，因此可以通过基因工程的手段过量表达嘌呤核苷酸［25］。

4 IMP和GMP的工业化生产

IMP和GMP作为风味增强剂已经实现了工业化生产，迄今为止已经发展了几种方法来改善生产流程。主要有以下两种策略:①RNA破碎和核苷酸提取;②通过发酵的方式生产嘌呤核苷酸。

4.1 以RNA破碎的方式提取IMP和GMP

第一种方法是基于细胞培养液的RNA提取，通过后续水解过程获得自由核苷酸［26］。大多数用于生产RNA的酵母菌都是具有高RNA含量的菌种，例如 Candida、Pichia、Saccharomyces或 Hansenula，而且已经进行了深入研究和基因修饰可以实现核苷酸的过表达［27］。

酵母菌的自溶是由热处理诱导的，然后通过乙醇沉淀RNA，因此可以通过化学或酶法获得获取自由核苷酸。在化学水解RNA过程中利用Ca(OH)2诱导进行核酸合成的干扰;相比之下，酶法需要溶解5'-磷酸二酯酶来获得自由核苷酸，使用最广泛的酶是来自青霉菌(Penicillium)的核酸酶P1［28］。

利用RNA生产IMP和GMP的主要缺点是副产品浓度相对较高，例如AMP、CMP和UMP等，它们不具有任何风味活性。因此，需要利用腺嘌呤脱氨酶的活性把AMP转化为IMP以及通过活性炭吸附去除 CMP 和 UMP［29］。

4.2 通过发酵方式从培养液中提取嘌呤核苷酸

第二种方法是直接通过发酵工程从菌体培养液中提取嘌呤核苷酸，所用的菌种常为通过随机诱变方法获得产量增高的突变菌株。

肌苷酸和鸟苷酸通常由发酵生产其前体肌苷和鸟苷，然后再经过化学处理或酶催化形成相应的磷酸衍生物［30］。最近科学家们通过基因突变的策略找到了直接生产IMP和GMP的方法［31］:通过对营养缺陷性菌株B.subtilis和C.ammoniagens的突变实现了IMP的过表达，该菌株具有较低的5-核苷酸酶活性和较高的细胞膜通透性，IMP的产率达到了20～27 g/L;同样的，在不同的鸟嘌呤缺陷型菌种如 C.glutamicum、C.ammoniagenes和 B.subtilis中，由于5-核苷酸酶活性较低也已经实现了IMP的过表达，最大产率为19 g/L。相比之下，尚未有直接生产GMP的报道，因此GMP是从IMP过表达菌株中经过两步反应过程生产的，即通过IMP氨基酶把IMP转化为GMP。最有效的生产菌株可从40 g/L IMP 中生产出 34.8 g/LGMP［32］。

5 菌株改造:代谢过程调控

在嘌呤合成途径中通过基因工程的手段(主要是基因敲除和代谢调整等)重新改变代谢的物质流向，使代谢朝着合成肌苷和鸟苷的方向进行，从而实现IMP和GMP的过表达。

在B.subtilis中，为了生产肌苷酸，进行了理性代谢工程探索。首先选择性失活腺苷酸琥珀酸合酶和肌苷5-磷酸脱氢酶，阻止IMP向AMP或GMP的转化;然后，使鸟苷/肌苷磷酸化酶失活，减少肌苷降解;最终，对嘌呤操纵子进行修饰，破坏嘌呤操纵子阻遏基因和5-UTR中鸟苷核糖开关的基因，优化Pur启动子中-10序列的碱基以增强嘌呤操纵子的转录活性。最终获得的突变菌株在30 g/L的葡萄糖培养基中可以获得6 g/L的IMP［33］。

近期通过多种策略试图构建生产GMP的C.glutamicum菌株［34］，这些策略主要包括:①通过删除编码6-磷酸葡萄糖异构酶的Pgi基因，增加核糖5-磷酸前体的可用性;②通过下调编码PRPP酰胺转移酶的PurF基因的表达，克服调节—抑制节点的瓶颈;③催化生产GMP的反应，如激活IMP—脱氢酶(催化把IMP转化为GMP)。通过13C代谢通量分析和代谢组分析确定了碳通量在工程菌细胞内的分布，由此确认PurA菌株是生产GMP的最优菌株［35］。

总之，在提高肌苷酸和鸟苷酸积累量的代谢过程中具有相同的部分特征，主要修饰范围可以分成五个部分:①中心代谢通量的重定向-增加核糖-5-磷酸的供应量;②从头合成途径的调节;③救助途径的修饰;④调控因子的改变;⑤增加分泌量。

6 结论

嘌呤类核苷酸的产率随着科学技术的进步而不断增加。合理的代谢设计和基因工程等现代技术相继出现在核苷酸生产领域，与前期的随机诱变方法相比有了突破性的提高。随着系统生物学的进步和合成生物学的快速发展，可为将来进一步提高发酵过程的生产效率提供操作基础。

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