超高压液相色谱－飞行时间质谱法分析牡丹皮化学成分

韩聪敏， 朱靖博， 丁 燕， 寇自农， 王振中， 萧 伟

（1.大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 分析测试中心，辽宁 大连 116034；3.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001）

0 引 言

牡丹皮（Moutan Cortex）系毛茛科（Ranunculacease）芍药属植物牡丹Paeonia suffruticaosa Andr.的干燥根皮，至今发现含有酚酸类、萜类、黄酮类、鞣质、甾醇等多类化学成分［1］，其主要有效成分为丹皮酚、芍药苷类及没食子酸［2］。牡丹皮化学成分分析的研究已有较多报道，均为HPLC－UV、HPLC－MS方法［3－5］，本文首次采用具有更高灵敏度和高分辨能力的UPLC／Q－TOFMS对牡丹皮甲醇提取物进行分析，并对芍药苷等单萜类化合物的质谱裂解途径进行探讨。

1 实 验

1.1 仪器、试剂和材料

ACQUITY UPLC／Q－TOF－MS 质 谱仪，美国Waters公司；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；UC－3120超声波振荡仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；MDF反渗透纯水机，大连美德环保设备有限公司。

乙腈（色谱纯），美国Fisher公司；甲醇（色谱纯），山东禹王实业。

牡丹皮药材由江苏康缘药业股份有限公司提供。

1.2 色谱条件

色谱 柱 Waters BEH－C18柱 （10.0mm×2.1mm i.d.，1.7μm）；流动相 A相为体积分数0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈；梯度洗脱条件为0～20min，5%～16%B；20～45min，16%～33%B；45～55min，33%～80%B；55～59min，80%～95%B；59～60min，95%～5%B。体积流量0.25mL／min，检测波长 254nm，进样量0.5μL，柱温为30℃。

1.3 质谱检测条件

ACQUITY UPLC／Q－TOF－MS 质 谱仪，配有电喷雾电离接口，正、负离子模式检测；使用高纯度氮气做雾化气和辅助气，氩气作碰撞气；正、负离子模式下毛细管电压为＋3和－3kV；离子源温度120℃；加热毛细管温度350℃；脱溶剂气体积流量800L／h，锥孔气体积流量50L／h；锥孔电压35V；正负离子模式下碰撞能分别为5.0和7.0eV；扫描范围m／z100～1 000。

1.4 样品制备

准确称取牡丹皮药材5.0g，加入100mL甲醇，超声提取3次，每次30min后过滤合并提取液，浓缩定容至10mL，分析前用0.22μm有机滤膜过滤。

2 结果与分析

2.1 牡丹皮提取物分析

以0.1%甲酸－水与乙腈溶液为流动性进行线性梯度洗脱得到了较好的分离结果（图1）。由于牡丹皮中化合物均有较多的羟基［3］，容易形成稳定的氧负离子，故负离子模式下检测到12个色谱峰，正离子模式下仅得到2个色谱峰，负离子模式更适合牡丹皮中化合物的质谱分析。

图1 牡丹皮甲醇提取物总离子流图Fig.1 TIC chromatogram of the methanol extract of Moutan Cortex

2.2 化合物的质谱图解析

采用提取分子离子峰与特征碎片离子方式，结合牡丹皮已发现化学成分，综合分析各化合物的色谱保留时间、相对分子质量、碎片离子信息以及相关文献数据推测确定了牡丹皮中没食子酸、芍药苷、丹皮酚等13个化合物。

峰1：图2A中有碎片离子m／z 169、125，推测碎片［M－H］－169为分子离子峰，碎片m／z125为分子离子失掉一个羧基—COO－（44u）形成的碎片离子，与文献报道的没食子酸（gallic acid）质谱数据一致［3－4］，峰1鉴定为没食子酸。

峰2：图2B中有碎片离子m／z463、301、169，牡丹皮中发现的化合物相对分子质量为464的化合物只有牡丹苷B（Mudanoside B），m／z 301为分子离子失掉一个葡萄糖（162u）形成，碎片m／z 169为没食子酸（gallic acid），与文献［4］报道一致，鉴定峰2为牡丹苷B。

峰3：图2C中只有碎片离子m／z 543，目前为止，牡丹皮相关文献未曾报道此条件的化合物，查阅芍药化学成分中存在的芍药苷亚硫酸酯（C23H27O13S，相对分子质量544）满足条件，离子碎片只有m／z543，与文献［6］报道一致，推测峰3为芍药苷亚硫酸酯。

图2 各色谱峰的质谱图Fig.2 MS spectrum of each peak

峰4：图2D有碎片离子m／z 495、991，推测碎片离子m／z495为分子离子峰，碎片离子m／z 991为［2M－H］－，符合已报道化合物氧化芍药苷质谱信息，同时其保留时间在峰5芍药苷之前，分子极性强于芍药苷，与报道文献［2，5，7］一致，推测峰4为氧化芍药苷。

峰5：图2E质谱图中存在碎片离子m／z 525、479、449、327、121，推测碎片离子m／z479为分子离子峰，碎片离子m／z 525为分子离子峰加上一分子甲酸（46u），分子离子失掉葡萄糖分子上甲氧基（30u）形成碎片离子m／z 449，进一步丢失一分子苯甲酸（121u）形成碎片离子m／z 327，m／z165碎片为碎片离子m／z327丢失一分子葡萄糖（162u）形成的芍药苷母核结构，结合正离子模式中出现的碎片m／z 503［M＋Na］＋，与文献［2］报道一致，鉴定峰5为芍药苷。

峰6：图2F质谱图中存在碎片离子m／z647、479、327、165、137，推断碎片离子m／z647为分子离子峰，碎片离子m／z 479为分子离子失去没食子酸（169u）形成，进一步丢失甲氧基（30u）及苯甲酸（121u）所形成碎片离子m／z 327，碎片m／z 165为碎片离子m／z327丢失一分子葡萄糖（162 u）形成的芍药苷母核结构［4，8］，鉴定峰6为没食子酰氧化芍药苷。

峰7、峰8：由图2G、H可以判断，分子离子峰为m／z787，同时均存在碎片离子［M－2H］2－ m／z 393，符合牡丹皮中发现的鞣质类化合物质谱特征［3］，推测峰7、8为鞣质1，2，3，6－tetra－O－galloy－D－glucose或1，3，4，6－tetra－O－galloy－D－glucose。

峰9：图2I中存在碎片离子m／z 939、469、769，分子离子峰为m／z 939，碎片离子m／z 469为［M－2H］2－，分子离子峰丢失一分子没食子酸（169u）得到碎片离子m／z 769，与文献报道一致［3，7］，由此推测峰9为鞣质1，2，3，4，6－penta－O－galloyl－β－D－glucose。

峰10、11：由图2J、K 中分子离子峰为［M－H］－ m／z599，牡丹皮中存在一对同分异构体苯甲酰氧化芍药苷和Mudanpioside C，两个化合物的色谱保留时间接近，结构上差异为苯甲酸和对羟基苯甲酸连接位置不同［1］，峰11中质谱碎片离子m／z447可推测为化合物中葡萄糖连接的苯甲酸（121u）及甲氧基（30u）断裂形成，参考文献［3－4］中两化合物色谱保留时间，由此可推测峰10为Mudanpioside C，峰11为化合物苯甲酰氧化芍药苷。

峰12：由图2L中碎片离子m／z 583为分子离子峰，m／z 553为分子离子峰丢失一分子甲氧基（30u）形成，碎片离子m／z 553进一步丢失一分子苯甲酸（121u）得到碎片离子m／z 431［2］，正离子模式下存在碎片离子m／z 607（［M＋Na］＋）及m／z623（［M＋K］＋），与文献报道［9］一致，鉴定峰12为苯甲酰芍药苷。

峰13：正离子模式下峰13的质谱图存在碎片离子m／z 167、149，可推断m／z 167为分子离子峰［M＋H］＋，碎片离子m／z 149为［M＋HH2O］＋，与文献［2］报道一致，峰13推测为丹皮酚。

表1 1～12号化合物的质谱裂解数据Tab.1 MS fragmentation ion of compounds 1－12

2.3 牡丹皮中单萜类化合物的质谱裂解归纳

从牡丹皮的甲醇提取物中鉴定了包括芍药苷在内的6个单萜类化合物，分析其共性归纳总结了此类化合物在负离子模式下的质谱裂解途径（图3），其裂解主要存在两种形式：第一种为首先断裂葡萄糖6号碳上的甲氧基－R，如芍药苷中碎片离子m／z 449，苯甲酰芍药苷碎片离子m／z 553、431以及 Mudanpioside C m／z 447，后苯甲酸－R基团断裂形成m／z 327的碎片离子，芍药苷、没食子酰氧化芍药苷中均含有碎片离子m／z 327；第二种为化合物分子首先丢失葡萄糖－R，后形成蒎烷基本骨架（m／z165）及苯甲酸－R基碎片离子，如芍药苷、没食子酰氧化芍药苷的碎片离子均含有m／z165，同时离子碎片存在苯甲酸－R基碎片m／z121或m／z137。

图3 牡丹皮中芍药苷类化合物负离子模式下可能裂解途径Fig.3 Proposed fragmentation pathways of the［M－H］－ion of Monoterpene glycosides in Moutan Cortex

3 结 论

采用UPLC／Q－TOF－MS对牡丹皮中的主要化学成分进行了结构鉴定，根据各个色谱峰在质谱中的精确分子质量、化学式和质谱碎片结构信息、质谱裂解途径和色谱保留规律，参考已有研究成果，鉴定了牡丹皮中的13种化合物，其中峰3芍药苷亚硫酸酯在之前牡丹皮已发现化学成分中尚未报道，对芍药苷等单萜类化合物的质谱裂解途径进行分析归纳。实验表明 UPLC／Q－TOFMS能有效分析和表征牡丹皮化学成分。

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