氮肥水平对玉米灌浆期穗位叶光合功能的影响

王 帅， 韩晓日， 战秀梅， 杨劲峰， 王 月， 刘轶飞， 李 娜

(沈阳农业大学土地与环境学院，土壤肥料资源高效利用国家工程实验室，农业部东北玉米营养与施肥科学观测试验站，辽宁沈阳 110866)

玉米是我国棕壤地区主要高产农作物之一，对我国粮食安全具有重要意义。玉米进行物质生产的基本生理过程就是光合作用[1]，而叶片是玉米主要的光合器官，有研究表明叶片早衰是限制高产的重要因素之一[2]。叶片衰老最主要的特征是叶绿体光合机构的瓦解及由此引起的光合功能下降[3]。叶片光合受抑制后，光激发能上升而且不能被及时耗散掉，导致产生过量的活性氧和膜脂过氧化产物，伤害PSⅡ反应中心供体侧和受体侧以及PSⅡ与PSⅠ之间的电子传递链，进而造成活性氧代谢失调、 生物膜的结构受破坏，最终使光合能力降低[4，5]。氮素是玉米生长发育过程中吸收最多的矿质元素，氮素也是棕壤地区限制玉米产量的主导因素之一。氮素作为蛋白质(酶)及核酸的重要组成元素，对器官建成、 光合作用、 源库关系等影响较大[6]，氮素亏缺直接影响玉米的光合作用，造成产量和品质下降[7，8]。适量施用氮素可以减少花后叶片中氮素的输出，延缓叶片衰老，维持较高的光合速率，为子粒灌浆提供充足的碳水化合物[7，9]。氮素通过提高PSⅡ与PSⅠ之间的协调性，增强光合电子传递链的性能，进而提高灌浆期光合速率和产量[10]。

叶绿素荧光动力学技术是研究植物光合功能的快速、 无损伤探针，近年来，快速叶绿素荧光诱导动力学曲线已成为研究光合作用，特别是原初光化学反应的有力工具之一[11， 12]。以前大多利用调制式荧光仪研究氮素对玉米叶片光合性能的影响，将光合机构整体对待，忽略了电子传递链中各个电子传递位点对氮素胁迫的响应[13]。快速叶绿素荧光诱导动力学曲线所包含的丰富和复杂的信息可以反映PSⅡ的原初光化学反应和光合机构状态的变化。Strasser建立的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的数据分析方法(JIP测定技术)[14]，为研究PSII反应中心的原初光化学反应建立了有效的方法。此外，应用PSⅠ对820nm光吸收曲线可以深入了解两个光系统的协调关系[15-17]。目前，国内关于氮肥对玉米光合荧光特性研究方面，是否施氮、 光氮互作等对荧光特性影响[10，13]，以及氮水平对不同品种荧光特性的研究已有报道[18]，但长期不同氮水平处理对同一玉米品种荧光特性影响研究未见报道。本试验以郑单958玉米为材料，在棕壤长期定位肥料试验的基础上，测定不同水平氮肥处理的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，分析了不同氮肥水平对灌浆期叶片光合性能指标的差异、 PSⅡ与PSⅠ性能及两系统间协调性的影响，以期探明玉米叶片光合性能对氮素水平的生理反应机制，探讨玉米灌浆期叶片衰老阶段光合性能降低的原因，为棕壤地区春玉米氮素高效管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验概况

大田试验于2012年在沈阳农业大学棕壤长期肥料定位试验基地进行。该基地始建于1979年，土壤为发育在第四纪黄土性母质上的简育湿润淋溶土(耕作棕壤)，作物轮作方式为玉米—玉米—大豆。供试玉米品种为郑单958，种植密度为60000 plant/hm2。试验前(1979年)土壤基本理化性状为： 有机质15.90 g/kg、 全氮0.80 g/kg、 全磷0.38 g/kg、 全钾20.1 g/kg、 碱解氮105.5 mg/kg、 速效磷6.5 mg/kg、 速效钾97.9 mg/kg，pH 6.5(水土比2.5 ∶1)。

1.2 试验设计

棕壤长期肥料定位试验采用裂区设计，主区分为不施、 低量(M1)、 高量(M2)3个有机肥处理，副区分为4个不同无机肥处理(N1、 N2、 N1PK、 N1P)和2个不施肥处理，共18个施肥处理，小区面积为160 m2。本研究选取其中的9个处理，具体施肥量见表1。玉米年份氮肥为尿素，有机肥为猪厩肥，有机质平均含量为119.6 g/kg，N 5.6 g/kg，P2O58.3 g/kg，K2O 10. 9 g/kg。氮肥2/3作追肥(大喇叭口期)，其余与猪厩肥、 磷肥、 钾肥一起撒施耙入表土层作基肥。

表1 试验处理及施肥量(kg/hm2)Table 1 Experimental treatments and fertilization quantity

1.3 测定项目与方法

于2012年玉米灌浆期(7月21日)，在天气晴朗无云条件下，选择植株生长一致、 无破损的健康穗位叶测定叶色值、 气体交换参数及叶绿素荧光特性，在收获期测定产量。

1.3.1 SPAD值的测定 应用手持式SPAD-502 Plus叶绿素测定仪(日本)测定玉米穗位叶中部及其上下约5 cm范围内10点的SPAD值，每小区选取3株，取平均值。

1.3.3 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定 以Schansker 等[19]方法为参考，应用连续激发式荧光仪M-PEA (Hansatech，英国)，叶片先暗适应30 min，然后测定叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)和对820 nm(远红光测量光为峰值820±20nm)的光吸收曲线。OJIP曲线由3000 μmol/(m2·s)的脉冲光诱导，荧光信号记录是从10 μs开始，至1 s结束，记录的初始速率为每秒钟118个数据，每小区选取3株，取平均值。

1.3.4 JIP-test分析 根据Strasser等的方法[20-21]，对获得的OJIP荧光诱导曲线进行分析。分析时需知Fo(20 μs时荧光，O相)、 Fk(300 μs时荧光，K相)、 Fj(2 ms时荧光，J相)、 Fi(30 ms时荧光，I相)、 Fm(最大荧光，P相)；Vk、 Vj和Vi(K、 J和I点的相对可变荧光)；可变荧光Fk占Fj-Fo振幅的比例Wk；捕获的激子将电子传递到电子传递链中QA下游的其他电子受体的概率Ψo；以吸收光能为基础的光化学性能指数PIABS；PSⅠ的最大氧化还原活性ΔI/Io=(I0.4-I40)/I0.4；PSI与PSⅡ协调性Ф(PSⅠ/PSⅡ)=(ΔI/Io)/Ψo。

1.4 统计分析方法

试验数据采用Microsoft Excel 2010 进行计算，用DPS 3.01和SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 土壤有机质和全氮含量

由图1可以看出，经过长期的定位施肥实验，各处理不同程度的提高了土壤的有机质和全氮含量，除高量有机肥处理外，施用氮肥处理均较不施氮肥处理提高了土壤的有机质和全氮含量。高量有机肥区组施用氮肥处理土壤有机质相对降低可能是由于氮肥的施用改变了土壤的碳氮比，从而加速了有机质的分解释放，造成土壤养分含量的降低，此外，M2N1处理产量最高，植物从土壤带走更多的养分，也造成土壤全氮等养分含量下降。

图1 氮肥对土壤有机质和全氮含量的影响Fig.1 Effects of N fertilizer treatments on soil organic matter and total N contents[注(Note)： 柱上不同字母表示不同处理差异达5%显著水平 Different letters above the bars means significant at the 5% level.]

2.2 玉米产量

图2表明，在不施有机肥的区组中，施用氮肥显著提高玉米产量；在施用低量有机肥的区组中，M1N2处理产量显著高于M1、 M1N1处理；而在施用高量有机肥的区组中，M2N1处理产量显著高于M2、 M2N2处理。可见经过33年的长期不同施肥处理，造成玉米产量上的显著差异，这主要是由土壤肥力变化造成，同时，不同处理间产量表现出一定的规律，即产量在一定水平下随施氮量的增加而升高，但在高量有机肥区组中施用高量氮肥已经表现出限制产量提高的作用。

2.3 SPAD值及叶片气体交换参数

表2表明，施用氮肥均显著提高玉米SPAD值，而不同施氮量间差异均不显著。不施有机肥区组中，各氮肥处理间气体交换参数差异均不显著。在施有机肥的两个区组中，不同施肥处理间净光合速率差异较显著，高水平氮肥处理的Pn显著高于低量氮肥；气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)的变化趋势表现为高水平氮肥处理高于低量氮肥处理；不同施肥处理中，除M2N2处理Ci显著高于其他处理外，其他处理间差异不显著。

图2 氮肥对玉米产量的影响Fig.2 Effects of N fertilizer treatments on yield of maize[注(Note)： 柱上不同字母表示处理间在0.05水平差异显著 Different letters above the bars indicate a significant difference among different treatments at the 0.05 level．]

表2 氮肥对灌浆期玉米穗位叶SPAD值及气体交换参数的影响Table 2 Effects of N fertilizer on SPAD and gas exchange parameters of maize ear leaves at the grain filling stage

注(Note): 同列数据后不同小写字母表示处理间差异达5%显著水平 Different letters mean values in the same column significantly different at the 5% level.

2.4 光系统Ⅱ(PSⅡ)性能

2.4.1 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线 与不施氮肥处理相比，施氮后郑单958穗位叶快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)变化显著(图3)，以不施氮的CK、 M1、 M2三处理的OJIP曲线作为参照，将各区组OJIP曲线标准化(ΔVt)后看出，施氮处理K点、 J点和I点的荧光强度均明显低于不施氮处理，其中J点降低幅度最大。随着有机肥施入量的增加，各氮肥处理间的荧光强度差异逐渐减小。

2.4.2 PSⅡ电子传递性能 激子将电子传递到电子传递链中QA下游的其他电子受体(QB)的概率Ψo是综合评价PSⅡ电子传递链性能的主要指标[10]。以吸收光能为基础的性能指数PIABS主要用于衡量PSⅡ整体性能。由图4可以看出，无有机肥区组中，施氮处理郑单958穗位叶Ψo和PIABS均较不施氮肥处理显著增加；施用有机肥区组中，施氮肥较不施氮肥处理Ψo有所增加，但差异不显著，而PIABS增加趋势显著。可见，氮肥处理对郑单958 PSⅡ反应中心之后电子传递链性能的提升作用更大。

图4 氮肥对灌浆期玉米穗位叶电子由QA传递到QB的概率(Ψo)与以吸收光能为基础的性能指数(PIABS)的影响Fig.4 Effects of N fertilizer treatments on probability of an electron moves from QA to QB (Ψo) and performance index on absorption basis (PIABS) of maize ear leaves at the grain filling stage[注(Note)： 柱上不同字母表示处理间在0.05水平差异显著 Different letters above the bars indicate a significant difference among different treatments at the 0.05 level．]

2.4.3 PSⅡ供/受体侧性能 与不施氮处理相比，施氮后玉米郑单958在K点的可变荧光Fk占振幅Fo-Fj的比例(Wk)和J点的可变荧光Fj占振幅Fo-Fp的比例(Vj)均下降(图5)。可以说明，施用氮肥使叶片PSⅡ反应中心电子传递链供体侧和受体侧的电子传递能力均有所增强，同时可以看出不同施氮量对受体侧性能的改善幅度大于供体侧。

图5 氮肥对灌浆期玉米穗位叶叶绿素可变荧光Fk 占Fo - Fj 振幅的比例(Wk) 与可变荧光Fj 占Fo - Fp 振幅比例(Vj) 的影响Fig.5 Effects of N fertilizer treatments on ratio of the variable fluorescence (Wk) at Fk to the amplitude Fo - Fj and the ratio of variable fluorescence (Vj) at Fj to the amplitude Fo - Fp of maize ear leaves at the grain filling stage[注(Note)： 柱上不同字母表示处理间在0.05水平差异显著 Different letters above the bars indicate a significant difference among different treatments at the 0.05 level．]

2.5 光系统Ⅰ(PSⅠ)性能

PSⅠ的最大氧化还原活性(ΔI/Io)反映PSⅠ反应中心P700的最大氧化还原能力，是对PSⅠ性能综合评价的重要指标[10]。由图6可以看出，施用氮肥处理郑单958叶片PSⅠ820nm光吸收量均较不施氮处理显著增加。图7为不同施肥处理PSⅠ的最大氧化还原活性(ΔI/Io)的统计结果，可以看出，施用氮肥处理最大氧化还原活性(ΔI/Io)较不施肥处理显著提高，其中高量氮肥处理下ΔI/Io均低于低量氮肥处理，说明氮肥不足或过量均降低叶片PSⅠ反应中心P700的最大氧化还原能力。

图6 氮肥对灌浆期玉米穗位叶820 nm相对光吸收值(It)及其差值(ΔIt) 的影响Fig.6 Effects of N fertilizer treatments on 820 nm relative light absorbance (It) and the difference of relative light absorbance (ΔIt) of maize ear leaves at the grain filling stage

图7 氮肥对灌浆期玉米穗位叶PSⅠ的最大氧化还原活性(ΔI/Io)的影响Fig.7 Effects of N fertilizer treatments on maximal oxidation-reduction activity of PSⅠ(ΔI/Io) of maize ear leaves at the grain filling stage[注(Note)： 柱上不同字母表示处理间在0.05水平差异显著 Different letters above the bars indicate a significant difference among different treatments at the 0.05 level．]

2.6 PSⅡ与PSⅠ间协调性

ΔI/Io和Ψo之间的协调关系可以表明两个光系统之间的协调性[10]。图8表明，PSⅠ与PSⅡ同时受红光激发时，施用氮肥处理郑单958穗位叶ΔI/Io与Ψo的相对变化量Ф(PSⅠ/PSⅡ)显著高于不施肥处理，其中高量氮肥处理下Ф(PSⅠ/PSⅡ)均低于低量氮肥处理，说明氮肥不足或过量均破坏叶片两个光系统之间的协调性。可见，适量的氮素处理可以增强郑单958叶片PSⅠ与PSⅡ之间的协调性。

图8 氮肥对灌浆期玉米穗位叶PSⅠ的最大氧化还原活性(ΔI/Io)与PS Ⅱ中电子由QA传递到QB的概率(Ψo)之间协调性Ф(PS Ⅰ/PS Ⅱ)的影响Fig.8 Effects of N fertilizer treatments on coordination performance Ф(PS Ⅰ/PS Ⅱ) between maximal oxidation-reduction activity of PS Ⅰ(ΔI/Io) and probability of an electron moves to QB from QA(Ψo) of maize ear leaves at the grain filling stage[注(Note)： 柱上不同字母表示处理间在0.05水平差异显著 Different letters above the bars indicate a significant difference among different treatments at the 0.05 level．]

3 讨论与结论

前人研究认为，光合活性的降低是叶片衰老的最主要特征[3]，也可能是诱发叶片衰老的信号[23]，植物的衰老或非生物胁迫等都直接或间接地影响植物PSⅡ的功能[24]。因为叶绿素荧光和光合原初反应存在着密切关系，它可以显示反应中心及供体侧和受体侧的氧化还原状态[25]，所以当环境条件变化时，叶绿素荧光的变化可以在一定程度上反映环境因子对植物的影响[26]。植物快速叶绿素荧光诱导曲线可分析出大量PSⅡ反应中心的信息，进而可深入分析环境变化对植物光合机构的影响。

肥料长期定位试验以长期固定的施肥模式按不同的方向持续改变土壤性质，能够加大各处理间土壤肥力和生产特性的差距，有利于系统研究土壤和作物演变特性[22]。有研究认为，土壤中氮素含量的多少主要取决于土壤有机质含量，施用有机肥可提高土壤有机质含量进而显著提高土壤氮素含量；而施用化肥氮提高土壤氮素含量的效应较小[22]。本研究中，经过33年的长期定位施肥，有机肥区组的氮含量显著高于不施有机肥处理，而不同施氮量处理间土壤氮含量差异不明显；有机肥处理产量显著高于不施有机肥处理，产量随施氮量的增加而小幅升高，但在高量有机肥区组中施用高量氮肥已经表现出限制产量提高的作用。

有研究表明，氮肥施用量对春玉米穗位叶的净光合速率、 叶绿素含量均有显著影响[7]。适量氮肥主要是通过提高玉米生育前期的叶绿素含量，保持生育后期较高的生物酶活性，来延长高光合持续期，达到高产。施氮不足，导致叶绿素含量一直不高，并且造成植株早衰，下部叶片过早枯黄，光合面积减小，造成减产。氮肥过量，虽能提高前期的叶绿素含量，但后期叶片生物酶活性降低，光合能力降低，产量不高[7]。前人研究氮素与作物光合特性的关系多从光合、 荧光的角度将光系统作为整体来研究，忽略了氮素对电子传递链中各位点的影响。本研究中施肥量、 土壤养分、 产量和各光合指标的相关性分析结果表明(表3)，土壤有机质含量、 全氮含量以及产量与玉米穗位叶的SPAD值、 PSⅡ电子传递性能、 PSⅠ氧化还原能力呈显著正相关，而与表观光合速率相关性不显著。这表明，长期施用有机肥较施用无机氮肥更能提高光合性能以及产量，而施氮后灌浆期叶片光合速率不是产量变化的主要原因，叶绿素含量的变化也不是Pn提高的主要原因；两个光系统性能的改善及二者间协调性的提高，改善了光合电子传递链的性能，进而提升灌浆期光合性能与增加收获期产量。

Ψo是对PSⅡ反应中心电子传递链性能的综合评价之一，受PSⅡ供体侧的电子供应能力和受体侧(包括PSⅠ)接收电子的能力制约，PIABS可以衡量PSⅡ整体性能[25]。施用氮肥显著提高Ψo和PIABS，说明PSⅡ反应中心电子传递链性能和PSⅡ整体性能均得到显著增强。典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线有O、 J、 I和P等相，如果在极短的时间内(即J点之前)，叶绿素荧光上升出现K点，则表明放氧复合体系统(OEC)的活性被抑制[27]，J点荧光的上升表明QA的大量积累。本研究表明施用氮肥可以引起OJIP曲线显著变化，降低K点和J点荧光强度值，施用氮肥可以降低放氧复合体系统的损伤程度。通过JIP-test 数据处理方法，比较K和J点相对荧光强度的大小变化(Wk和Vj)，可以计算出OEC受损程度与QA积累程度[28]。本研究表明，施氮处理K和J点相对荧光强度Wk和Vj均有所降低，Vj降幅小于Wk，说明施氮可以增强叶片PSⅡ反应中心电子传递链供体侧和受体侧的电子传递能力，增强放氧复合体和QA之后电子传递链的活性；其中对PSⅡ反应中心电子受体侧性能的改善大于供体侧。本研究认为氮肥不足造成减产主要是由放氧复合体系统活性受到抑制进而光合性能下降引起的。

PSⅠ的最大氧化还原活性(ΔI/Io)则反映了PSⅠ反应中心P700的最大氧化还原能力，是对PSⅠ性能的综合评价，本研究表明，施用氮肥处理显著增加穗位叶对820nm光吸收量，还可以提高PSⅠ的最大氧化还原活性ΔI/Io，但是高量氮肥处理下ΔI/Io均低于低量氮肥处理，说明适量施氮有效提高PSⅠ反应中心P700的最大氧化还原能力，氮肥过量降低P700的最大氧化还原能力，本研究认为氮肥过量引起PSⅠ在灌浆期出现功能衰减，从而抑制了电子从PSⅡ进入PSⅠ，抑制光合电子的传递，导致光合受阻。

表3 各指标相关性分析Table 3 The correlation analysis among determined parameters

注(Note)：M—有机肥 Manure; N—氮肥 N fertilizer; SOM—有机肥 Soil organic matter; STN—土壤全氮Soil total N; Y—产量 Yield; Pn—净光合速率 Net photosynthetic rate; Ψ0—电子由QA传递到QB的概率 Probability of an electron moves to QBfrom QA; PIABS—以吸收光能为基础的性能指数 Performance index on absorption basis; ΔI/I0—PSⅠ的最大氧化还原活性 Maximal oxidation-reduction activity of PS Ⅰ. *和**分别表示在0.05和0.01水平显著 Indicate significance at the 0.05 and 0.01 levels, respectively.

有研究表明如果PSⅡ和PSⅠ之间电子传递受阻就会导致PSⅠ/PSⅡ的失衡，叶片的Pn就会相应地下降[29]，PSⅠ性能的强弱不仅受自身性能的影响，同时还受到PSⅡ性能的影响[19]。前人研究表明，氮素对叶片PSⅠ性能提升作用显著大于PSⅡ反应中心[10]，本研究也得出相似结论。施用氮肥处理ΔI/Io与Ψo的相对变化量Ф(PSⅠ/PSⅡ)显著高于不施肥处理，低量氮肥处理下Ф(PSⅠ/PSⅡ)均高于高量氮肥处理，说明氮肥不足或过量均破坏叶片PSⅠ与PSⅡ两个光系统之间的协调性。由此推断施氮调节PSI/PSII平衡可能是促使QA之后电子传递链效率提高、 提升整个电子传递链功能的主要原因。

综上，施用氮肥可以引起荧光诱导曲线(OJIP曲线)显著变化，其中K、 J和I点的荧光强度值明显降低；施用氮肥显著提高捕获的激子将电子传递到电子传递链中QA下游的其他电子受体的概率(Ψo)和以吸收光能为基础的性能指数(PIABS)，显著降低K点的可变荧光Fk占振幅Fo-Fj的比例(Wk)和J点的可变荧光Fj占振幅Fo-Fp的比例(Vj)，说明PSⅡ反应中心电子传递链综合性能以及供体侧和受体侧的电子传递能力均明显提高，并且可以看出受体侧性能的改善大于供体侧；随着施氮量的增加，PSⅠ的最大氧化还原活性ΔI/Io呈先升后降的趋势变化，说明适量施氮可以增强P700的最大氧化还原能力，并可以显著提高叶片PSⅠ与PSⅡ两个光系统之间的协调性Ф(PSⅠ/PSⅡ)。

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