帕金森病患者外周血纯真、记忆和调节T细胞亚群分析

郝娟 于顺 陈彪 李尧华

帕金森病(Parkinson disease，PD)是常见的神经系统退行性疾病之一[1]。PD的病因和发病机制尚未完全明了。许多研究结果显示PD患者外周血T淋巴细胞亚群比例失衡及T细胞免疫功能下降，提示免疫应答所致慢性神经炎性反应是PD发生发展的机制之一[2-3]。本研究采用流式细胞术对PD患者外周血T淋巴细胞中的纯真细胞亚群、记忆细胞亚群和调节性细胞亚群的变化进行检测，旨在探讨其在PD发病中的作用。

1 对象和方法

1.1研究对象(1)病例组：共34例，其中男17例，女17例，年龄37～70岁, 平均(51.84 ±8.86)岁。病程1～5年，平均(2.8 ±0.8)年。均符合中国PD诊断标准[4]。将PD患者按改良Hoehn-Yahr[4]分级法分级，均处于Ⅰ～Ⅲ级，属于轻中度患者。(2)对照组：共35名，其中男17名，女18名，年龄35～73岁，平均(53.86 ±10.26)岁，均系健康志愿者，无明显疾病史。入选和排除标准：排除自身免疫性疾病、正在使用对免疫系统有影响的药物以及患有影响免疫系统疾病的患者。

1.2方法采用微量全血直接免疫荧光染色法检测外周血T淋巴细胞亚群。主要仪器和试剂包括Facscalibur、Accuri C6流式细胞仪以及小鼠抗人CD3PERCP、CD4FITC、CD8PE、CD45RAFITC、CD45ROAPC、CD25APC、FoxP3PE免疫荧光抗体，均购自美国BD公司。

1.3统计学处理采用SPSS17.0统计软件包进行分析，计量资料均采用均数±标准差表示，两组均数间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与对照组比较，PD患者外周血总淋巴细胞百分比降低，杀伤性纯真T细胞亚群(CD8+CD45RA+CD45RO-)百分比增高，杀伤性记忆T细胞亚群(CD8+CD45RA-CD45RO+)和调节性T细胞亚群(CD4+CD25+FoxP3+)百分比均降低(均P<0.01)，而CD3+CD4+T细胞亚群和CD3+CD8+T细胞亚群占总淋巴细胞的百分比与健康对照组比较无统计学差异，辅助性纯真T细胞亚群(CD4+CD45RA+CD45RO-)和辅助性记忆T细胞亚群(CD4+CD45RA-CD45RO+)与健康对照组比较亦无统计学差异(表1)。

表 1 两组T淋巴细胞亚群检测结果比较

3 讨论

PD是常见的中枢神经系统退行性疾病之一，免疫应答机制在其发生和发展过程中发挥作用[5]。淋巴细胞是机体免疫系统的重要组成部分，直接参与机体的先天性免疫和获得性免疫。本研究结果显示，PD患者外周血总淋巴细胞百分比明显低于健康对照组，这与Gruden等[6]和Mosley等[2]的报道一致，提示PD患者存在免疫系统功能异常。

CD3+CD4+T细胞和 CD3+CD8+T细胞是两个功能不同的T细胞亚群。健康人体内CD3+CD4+T细胞亚群多于CD3+CD8+T细胞亚群，二者比值大于1.0。有研究结果显示[7]，PD患者CD3+CD4+T细胞亚群占总淋巴细胞百分比较健康人变化不大，CD3+CD8+T细胞亚群占总淋巴细胞百分比较健康人有所升高，导致CD3+CD4+T/CD3+CD8+T的比值稍下降。本研究结果显示，PD患者CD3+CD4+T细胞亚群和CD3+CD8+T细胞亚群各占总淋巴细胞(CD3+T细胞)的百分比与健康对照比较无统计学差异，这可能与研究的抽样误差有关，具体结果有待进一步论证。

CD45RA和CD45RO是CD45(白细胞共同抗原)的两类亚型，由CD45肽链胞外区氨基端的3个外显子发生旁路剪接而致，缺乏3种外显子的同型称为CD45RO，仅表达外显子A的同型称为CD45RA。CD45RO+T细胞表现为记忆细胞的特点，具有辅助诱导作用；而CD45RA+T 细胞却表现为初始T细胞的特点，具有抑制免疫的作用。CD45RA+T细胞亚群和CD45RO+T细胞亚群的变化可能在很多疾病中均可作为疾病活动、复发和疗效的判定指标之一，具有重要的临床意义。本研究结果显示，PD患者外周血辅助性纯真T细胞亚群(CD4+CD45RA+CD45RO-)和辅助性记忆T细胞亚群(CD4+CD45RA-CD45RO+)较健康人无明显变化，这与以往研究结果一致[7]。有文献报道[2，8-9]，PD患者的CD4+CD45RO+T细胞亚群较健康人显著升高，并且其升高程度和帕金森综合评分量表(UPDRS-Ⅲ)评分呈中度正相关，而PD患者CD4+CD45RA+T细胞亚群较健康人有选择性丢失，但目前尚未见有关PD患者CD8+CD45RA-CD45RO+T细胞亚群和CD8+CD45RA+CD45RO-T细胞亚群变化的报道。CD45RO曾一度被认作记忆性T细胞的标志，但最近研究表明，它是细胞新近活化的象征：静止的T细胞表达CD45RA，但活化后立即改为CD45RO，几周后又恢复表达CD45RA，PD患者外周血某些细胞因子如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和淋巴细胞功能相关分子( LFA-1)等水平增加，可能是导致CD4+和 CD8+T细胞亚群中 CD45RA+细胞比例下降，CD45RO+细胞比例升高的原因之一[10]。本研究结果显示CD8+CD45RA-CD45RO+T细胞亚群较健康人减少、CD8+CD45RA+CD45RO-T细胞亚群较健康人增多，提示PD患者杀伤性T细胞活化过程可能受到影响，也可能与所有PD患者都服用多巴胺制剂有关。因为服用多巴胺制剂会导致T细胞蛋白质表达谱的改变，进而可能会对PD患者的免疫功能造成一定影响[11]。

调节性T细胞(Treg)是不同于 Th1 和 Th2 细胞的一种 CD4+T细胞亚群，具有维持机体自身免疫耐受的作用，通过抑制免疫亢进调节机体免疫平衡，避免自身免疫病的发生，其表面标记为CD4+CD25+FoxP3+。本研究发现PD患者Treg较健康人减少，与文献报道结果[12]一致。动物实验表明[13]，Treg细胞减少能够导致小胶质细胞炎性反应加速，促进黑质纹状体神经元死亡，从而加重 PD病情。在神经保护方面，Treg细胞能够通过抑制抗原提呈细胞(APC)提呈抗原的表达，抑制获得性免疫的发生和效应性T细胞增殖，诱导免疫细胞由Th1、Th17等效应性T细胞向Th2漂移，进而抑制神经免疫炎性反应的发生。在PD动物模型中，Treg细胞可以通过血-脑脊液屏障到达神经炎性反应部位，通过释放白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)和FasL，进一步诱导活化型小胶质细胞向静止型小胶质细胞转变，或直接诱导活化性小胶质细胞凋亡，减少神经损伤，从而进一步抑制了活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、过氧化亚硝基(OONO-)的释放。另外，Treg细胞还能分泌脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等神经营养因子[2,14-15]。

综上所述，PD患者外周血淋巴细胞中杀伤性纯真T细胞亚群、杀伤性记忆T细胞亚群及调节性T细胞亚群百分比与健康者间存在统计学差异，细胞免疫失衡可能参与了PD的病理进程。PD 患者体内Treg 细胞减少，加重了神经免疫炎性反应，而Treg细胞的增多可以起到神经保护作用，延缓PD进程。由于TGF-β、IL-2、 IL-10、全反式维甲酸等细胞因子可以促使T细胞向Treg细胞发生转化[2]，提示通过体内诱导Treg细胞可能为治疗 PD 提供新的思路。

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