大脑中动脉线栓法脑缺血模型制作的改进及经验探讨

卢 英，蔡光先*，谭 琥，邓叔华，易 健，刘柏炎

（1.湖南中医药大学2011级硕士研究生班，湖南 长沙 410208；

2.湖南中医药大学第一附属医院省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410007；

3.益阳医学高等专科学校，湖南 益阳 413000）

大脑中动脉线栓法脑缺血模型制作的改进及经验探讨

卢 英1，蔡光先2*，谭 琥2，邓叔华1，易 健2，刘柏炎3

（1.湖南中医药大学2011级硕士研究生班，湖南 长沙 410208；

2.湖南中医药大学第一附属医院省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410007；

3.益阳医学高等专科学校，湖南 益阳 413000）

目前局灶性脑缺血动物模型最常用的方法是大脑中动脉线栓法（MCAO），但该方法仍存在技术要求高、模型差异性大、动物死亡率高等缺陷。因此，如何建立稳定、可靠、重复性高的MCAO动物模型成为我们亟需解决的问题。从实验动物、麻醉药物、栓线的选择，手术流程、术后护理等多个方面进行探讨，以期提高MCAO脑缺血动物模型的成功率。

大脑中动脉线栓法；脑缺血；模型大鼠

局灶性脑缺血动物模型的制作方法众多，其中大脑中动脉线栓法 （Middle cerebral artery occlusion，MCAO）以其不开颅、易操作、损害小及对生理指标影响小等优点受到学者们的高度重视，广泛应用于药效的评价及脑缺血-再灌注多方面的研究[1]。目前国内所用MCAO操作流程均参照Longa等的方法，但该操作流程技术要求高，不同的人造出的模型差异性大，动物死亡率高，大大降低了它的可比性和实用性。本实验室近10年来使用MCAO大鼠模型进行脑缺血实验研究，完成了多个973，国家自然基金，省、厅级课题，手术成功率达80%以上。因此，本文结合文献查阅的方法，将MCAO模型制备遇到的问题及解决方法做一介绍，供同仁参考。

1 实验动物（Experimental Animal）

MCAO动物模型最初主要用大型动物作为研究对象[2]，但大动物购买费用高，梗死灶变化较大，不利于实验研究。因此，目前MCAO模型所选动物绝大部分是啮齿类动物[3]。在啮齿类动物中，大鼠的脑血管与人类的脑血管具有相似性，且其有较强的抗感染力、成本低、种系内纯合性好等特点，被广泛用于脑缺血实验。国内实验室所用大鼠主要有SD和Wistar两个品系。相比较而言，SD大鼠可见恒定的顶颞皮质梗死灶，梗死体积大于Wistar大鼠，变异较小，缺血半暗带所占体积明显小于Wistar大鼠[4]，因此多首选SD大鼠。另外，由于不同体质量大鼠大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）的粗细及长短差距较大，这在很大程度上影响着模型的成功率。目前多数文献认为大鼠体质量应该控制在 250～ 350 g之间[5]，但本实验室认为以控制在260～300 g之间为宜。理由有三:第一，大鼠手术前禁食12 h后，体质量会减轻14～15 g；第二，禁食后体质量小于250 g的大鼠，对麻醉药耐受差，鱼线难以插入，且术后大鼠易死亡；第三，禁食后体质量大于290 g，甚至300 g以上的大鼠侧支循环能在较短时间内建立完善，神经功能恢复快，不利于药物效果的评价。

2 麻醉剂（Anesthetics）

脑缺血手术中大鼠需要在全身麻醉的情况下进行，但全身麻醉对动物的血液循环、呼吸、脑代谢等均具有较大的影响，甚至直接导致动物死亡，因此需选择合适的麻醉剂。实验所用麻醉剂分为气体吸入麻醉和腹腔注射麻醉，但气体麻醉设备要求高、作用时间短，故未被国内大多数人采用。水合氯醛和戊巴比妥钠均通过腹腔注射，操作简单，麻醉时间适中，是目前国内主要的麻醉剂。有研究[6]认为水合氯醛对胃肠道及呼吸道影响较大，动物苏醒后状态不佳，而戊巴比妥钠较少出现上述现象；但有学者[7]认为巴比妥类对脑缺氧有保护作用，故不应该用于脑缺血实验。实验中发现，当水合氯醛过量时大鼠会出现口、鼻分泌物增多等现象，只要掌握好剂量即可避免这种现象。因此，推荐使用10%的水合氯醛麻醉，但需注意以下几点:第一，配水合氯醛时称量要严格；第二，现配现用；第三，严格按动物体质量计算药量，体质量在260～300 g的大鼠，麻醉量应在0.35 mL/100 g的基础上加0.1 mL效果最佳，这时的大鼠全身松软，不能自主运动，生命体征平稳，能耐受整个手术过程；第四，若大鼠未完全麻醉，可根据大鼠麻醉程度加量，即大鼠能够绑于鼠板上，但分离筋膜时有挣扎，可加0.1～0.2 mL；备皮时挣扎加0.2～0.3 mL；能够爬或不能绑在鼠板上，加0.5 mL。

3 栓线（Plug Line）

目前多数实验室用钓鱼线做栓线，但鱼线有直径和硬度的区别。一般实验人员只考虑鱼线大小是否合适，并未考虑鱼线硬度与模型成功之间的关系。关云谦等[8]研究发现，相同直径的鱼线，随着鱼线硬度的增加，蛛网膜下腔出血的发生率呈明显上升趋势，模型成功率明显下降。因此，相同直径的鱼线，以硬度稍软的为佳，但需要注意的是鱼线过软不利于插入MCA中。在鱼线直径的选择上，本实验室认为禁食后体质量在250～290 g的大鼠，鱼线选择直径为0.25 mm的较为合适。

手术前鱼线的处理相当重要，Longa等的方法与栓线法创始者Koizumi等的方法，主要差别是栓线头的处理不同:Koizumi等在栓线一端涂布硅胶，而Longa等则是将栓线一端在火焰上烧灼处一个钝头[9]。虽然二者的处理方法不同，但都是为了减少栓线头对血管的损伤，而Shimamura[10]证实，处理过的栓线确实能够提高大鼠的存活率、减少梗死体积变异以及产生一致性较高的神经功能评分。目前国内对鱼线头的处理上，主要有以下三种方法[3]:（1）直接将头端用酒精灯或电烙铁烫成光滑而膨大的球形；（2）在鱼线表面涂以化学物质，如硅胶、石蜡等；（3）将头端烫圆后再涂上0.1%左旋多聚赖氨酸。本实验室则是将鱼线头直接在炽热的白炽灯表面摩擦，使线头光滑，不会划伤血管即可。线头处理好后的鱼线需要用黑色油性记号笔做标记，以便手术过程中节省时间。之后将鱼线放入75%乙醇中浸泡至少1 h，再用生理盐水冲洗干净。这时直接将鱼线放入干净的培养皿中保存，但也有人会将鱼线再用肝素浸泡，以防止鱼线插入MCA后引起血栓形成。鱼线是否有必要用肝素浸泡，目前尚无专门的文献报道。但是需要指出的是，肝素浸泡后的鱼线会变直，这不利于鱼线插入MCA。

4 手术流程（Surgical Process）

Longa的操作方法有诸多不合理的地方，因此目前多采用改良的Longa方法。首先，切口位置的选择，杨赞章等[11]认为颈旁切口出血较正中切口少，视野暴露充分；先雄斌等[4]进一步指出切口应在颈前正中线外侧约0.5 cm处，切口长约2.5 cm。其次，传统方法是撕裂胸骨舌骨肌并暴露气管，从气管旁分离左侧颈总动脉 （common carotid artery，CCA）等，这种方法一方面会损伤气管，影响大鼠呼吸，另一方面不利于术后伤口的恢复。因此，现在多采用钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌间的肌间隙，暴露CCA和迷走神经，从而避免伤及气管。另外杨赞章等[11]主张在暴露的切口处滴上少许利多卡因，以减轻对迷走神经和气管的刺激。再次，在颈外动脉（External carotid artery，ECA）、颈内动脉（Internal Carotid artery，ICA）分支的处理上也与Longa的方法有很大差异。如吴培要等[12]分离出ICA和枕动脉，用烧灼法离断枕动脉，在ECA下穿线2根，线一离CCA分叉处3 mm结扎不剪断，线二不结扎以供牵拉备用，动脉夹夹闭CCA、ICA，于2根线之间的ECA剪一切口，将栓线由此口插入，进入ICA；崔利德等[13]则在ECA的起始处穿线并结扎该动脉，然后在CCA的近心端穿线并结扎该动脉，并留一线备用，用动脉夹夹闭CCA的末端，然后在CCA近动脉夹处用眼科剪剪一小口将栓线插入，接着用备用线系住，防止出血，放开动脉夹插线。本实验室认为吴氏等的方法需要分离出一定长度的ECA，且要用烧灼法切断ECA和枕动脉，很容易伤及ICA及周围神经，且延长手术时间，增加手术风险；而崔氏等的方法与本实验室的相似，但也有不同之处。本实验室在结扎ECA后，用1个动脉夹夹住ICA，且尽可能远离三岔口处，1个动脉夹夹住CCA，且尽可能远离三岔口处，用穿线贴着动脉夹结扎CCA（勿剪断，备用），松开动脉夹。在CCA上稍远离三岔口的位置用眼科剪剪一小口将栓线插入ICA内，此时松开ICA上的动脉夹，同时用一手拉紧CCA上的结扎线，防止动脉夹松开后ICA出血。最后，将栓线继续插入，直到栓线标记处达到三岔口处停止，此时会感到有轻微阻力，然后迅速用穿线将ICA结扎。在此过程中，需要特别注意的是ICA上的唯一分支——翼腭动脉 （Pterygopalatine artery，PPA），若鱼线只插进10 mm就有明显阻力，则提示鱼线插入了PPA。对于新手来说这是经常会碰到的情况，且多次调整方向后仍会插入其中，这是手术失败的最常见原因。因此，Woitzik J等[14]提出可通过事先结扎PPA的方法来解决这个问题。但这种方法不可取，因为PPA位置较深，结扎PPA需要继续沿ICA分离肌肉，但该处有迷走神经及其他小神经和小血管经过，分离该处肌肉将会增加出血风险和神经损伤风险，且不利于大鼠术后的恢复。

本实验室操作流程:在大鼠两前肢连线稍上方与前正中线旁开0.5～1 cm交叉处，用手术剪向大鼠嘴部方向剪一适当口子 （长度根据操作者手术熟练度而定，一般在2.5 cm以内）。然后用手术弯镊钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌间的肌间隙，此时视野下可见由前斜角肌、中斜角肌、后斜角肌等颈深肌汇聚成的三角形区域，CCA就在该三角区下面靠内侧部位，沿着这些肌间隙继续钝性分离，即可见一搏动的红色血管，此即CCA，在其外侧紧靠着迷走神经 （有时迷走神经也可贴在CCA上面），用镊子将CCA和迷走神经游离出来，并使迷走神经置于CCA的外侧，在CCA上穿一结扎线。沿着CCA继续游离出ICA和ECA，并在ICA和ECA上各穿一结扎线。需要注意的是在CCA、ICA和ECA交叉处有一小血管即枕动脉，在游离ECA和ICA时枕动脉容易破裂出血，游离时需谨慎。将游离的ECA结扎，结扎处尽可能靠近三岔口处，以防止插鱼线时鱼线进入ECA。之后用1动脉夹夹闭ICA，再用另一动脉夹夹闭CCA近心端，然后结扎CCA。在CCA上用眼科剪剪一小口，将鱼线插入到ICA后松开ICA上的动脉夹，继续将鱼线插入，直至达到MCA。结扎ICA，完成手术。

5 术后护理（Postoperative Care）

术后大鼠放于装有干净垫料的鼠笼，取侧卧位，并用垫料盖住大鼠身体及创口，有条件的也可在鼠笼中垫双层干燥的棉布，再用干燥手术铺巾盖于大鼠上，在鼠笼内放一些饲料，饮用水为1%蔗糖水，并使动物房保持在26℃。待大鼠完全清醒后开始做神经功能评分。另外，为了防止术后感染，检测指标与炎症无关时可考虑术后前3 d每天腹腔注射青霉素，按4万U/只大鼠。

6 模型评价（Model Evaluation）

模型评价方法有多种，如神经功能损伤行为学评价、脑组织干湿重、脑组织TTC染色、HE染色和CT灌注扫描等。其中脑组织干湿重和脑组织TTC染色能较直观地了解大鼠脑缺血情况，但需要一定的仪器设备和试剂，花费大，且需要处死大鼠，增加实验大鼠数量；CT灌注扫描是近年来随着影像学的发展而出现的，CT灌注扫描对梗死模型进行筛选可进一步降低由模型变异引起的实验误差，为实验研究提供实时可靠信息[15-16]。但该方法实验仪器要求更高，花费更大，不适合普通实验研究。神经功能损伤行为学评价常用的方法有姿势反射实验、走木条实验、肢体放置实验及抓握-牵拉实验[17]。其中姿势反射实验最为常用[18]。姿势反射实验主要用于评估永久性或暂时性MCAO模型中的皮质梗死，评估对侧肢体感觉运动及行为能力。目前多用Bederson方法或其改良方法。

本实验室在长期的实验观察中发现，Bederson方法及其改良方法并不适用于长期的神经功能损伤评估，尤其是在术后2周后很难判断大鼠功能损伤分数。因此，在使用神经功能损伤评分时，在Bederson评分法的基础上，加用了Ayelet Levy评分法[19]。术后大鼠清醒后将进行Bederson评分，将分数为0分和4分的大鼠剔除掉；Ayelet Levy评分则用于评估大鼠在各个时间点的神经功能恢复情况。

7 总结（Summary）

总之，MCAO脑缺血模型制作需注意以下几点:（1）大鼠体质量应在260～300 g之间；（2）麻醉药物可选择10%水合氯醛，现配现用，麻醉量应在0.35 mL/100 g的基础上加减0.1 mL效果最佳；（3）手术操作规范化，注意术中血管分离方法及鱼线插入深度；（4）注意术后大鼠护理；（5）选择合理的模型评价标准，尤其是神经功能损伤评分标准。这样制作的模型更加稳定、可靠和重复性高，使实验更具有可比性、可重复性。

[1]黄玉兰，杨肖敏，石广霞，等.各种脑缺血动物模型研究现状[J].中国中医急症，2011，20（12）:1 985-1 987.

[2]马 宁，蔡继福，姜卫剑.局灶性脑缺血动物模型的制备[J].神经损伤与功能重建，2010，5（1）:53-55.

[3]邹永杰，崔高宇，冯 华.脑缺血动物模型的研究进展[J].国际神经病学神经外科杂志，2012，39（5）:423-426.

[4]先雄斌，杨朝鲜.大鼠脑缺血再灌注模型的建立[J].中国老年学杂志，2009，29（19）:2 521-2 522.

[5]李德辉，吴卫华，刘志刚，等.线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型的实验研究[J].大理学院学报，2009，8（10）:31-33.

[6]汪 静，丁 隽，姜 莹，等.两种麻醉剂对KM小鼠麻醉效果的比较[J].实验动物与比较医学，2009，29（2）:132-134.

[7]胡建鹏，王 键.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型研究中的几个问题[J].中国比较医学杂志，2004，14（2）:115-118.

[8]关云谦，陈 彪，周 茗，等.尼龙线直径和硬度对大鼠线栓法脑缺血模型成功率的影响[J].中国医学科学院学报，2004(5):600.

[9]窦万臣，王任直，张 波，等.大鼠局灶性脑缺血模型制作方法的改进[J].中国脑血管病杂志，2004，24（4）:450-452.

[10]Shimamura N，Matchett G，Tsubokawa T，et al.Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model[J].J Neurosci Methods，2006，156(12):161-165.

[11]杨赞章，陈 虹.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的改进与体会[J].时珍国医国药，2008，19（9）:2 189-2 190.

[12]吴培要，王 静，谢丽芬，等.线栓大鼠大脑中动脉缺血模型制作方法的改进[J].贵阳医学院学报，2009，34（1）:108-110.

[13]崔利德，徐旭东.鼠大脑中动脉阻塞脑缺血模型栓线的改进[J].济宁医学院学报，2009，32（5）:359-360.

[14]Woitzik J， SchneiderUC， Thome C， etal.Comparison of different intravascular thread occlusion models for experin ental stroke in rats[J].J Neurosci Methods，2006，151(2):224.

[15]张晓波，金征宇，李明利，等.大鼠急性脑缺血再灌注模型的建立及CT灌注扫描的评价[J].基础医学与临床，2006，26（6）:631-634.

[16]尹 峰，綦书抑，朱 静，等.CT灌注成像实时评价大鼠急性脑缺血再灌注模型 [J].哈尔滨医科大学学报，2009，43（6）: 544-547.

[17]刘小蒙，王荣亮，罗玉敏.大鼠脑缺血神经功能缺损行为学评价的研究进展[J].中国脑血管病杂志，2012，9（4）:208-211.

[18] Liu Y， Xue F，et al. Helium preconditioning attenuates hypoxia/ischemia-induced injury in the developing brain[J]. Brain Res，2011，28(2):122-129.

[19]Ayelet Levy，Adi Bercovich-Kinori，Alexander G，et al.CD38 facilitates recovery from traumatic brain injury[J].Ournal OF Neurotrauma，2009，26(9):1 521-1 533.

（本文编辑 匡静之）

Experience and improvement of preparation of the cerebral ischemia model by string-fastenings method for middle cerebral artery occlusion

LU Ying1,CAI Guangχian2,TAN Hu2,DENG Shuhua1,YI Jian2,LIU Boyan3
(1.2011 Class of master degree candidate,Hunan University of CM, Changsha,Hunan 410208,China；
2.Key Laboratory of Ministry of Education,First Affiliated Hospital,Hunan University of CM, Changsha,Hunan 410007,China；
3.Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China)

The most common method for establishment of animal model of focal cerebral ischemia isthestring-fasteningsmethod formiddle cerebralartery occlusion,butthere are severaldefectsforthe method such asdemanding technics,marked differencesin model animals,high mortality.Therefore,establishing a stable,reliable,and reproducible animal model of focal cerebral ischemia has become an urgent problem.The choice of animal,anesthetic drugs and bolt lines,surgical procedures and postoperative care are discussed in this article in order to improve the success rate of focal cerebral ischemia model by the suture of middle cerebral artery.

the string-fastenings method for middle cerebral artery occlusion;cerebral ischemia;model rat

R743；Q95-33

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.002.006.04

2013－10－30

国家自然科学基金（81072939，81273989）；湖南省高校创新平台开放基金（09K056，10K048，12K089）。

卢 英，女，在读硕士研究生，主要从事中医药防治脑血管病研究。

*蔡光先，男，教授，博士研究生导师，E-mail:lby1203@sina.com。