有柄石韦中黄酮类成分的分离纯化工艺的研究

韩晨晨，程丹丹，张颖颖，高德民*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 基础医学院，山东 济南 250355)

中药石韦为水龙骨科(Polypodiaceae)植物石韦属(Pyrrosia)有柄石韦的地上部分[1]。性甘、苦，微寒。归肺、膀胱经。具利水通淋，清肺泄热之功效，可治淋痛，尿血，尿路结石，肾炎，崩漏，痢疾，肺热咳嗽，慢性气管炎，金疮，痈疽等[2]。石韦煎剂对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌等有不同程度的抑制作用[3]。临床中用石韦治疗支气管哮喘、慢性支气管炎、急、慢性肾炎及肾盂肾炎等疾病，具有较好的效果。

黄酮类化合物是天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基的生理活性，且具有抗癌、抗衰老和抗氧化等多种药理作用，因此对有柄石韦中黄酮类成分提取纯化工艺的探讨具有重要意义。

1 仪器与试剂

1.1 材料

有柄石韦(购自建联中药店)。

1.2 主要试剂

芦丁对照品(生化试剂，上海阿拉丁试剂有限公司)，乙酸乙酯、正丁醇、乙醚(天津市富宇精细化工有限公司)和石油醚(天津市达森化工产品销售有限公司)均为分析纯。95%乙醇、亚硝酸钠(AR)、氢氧化钠(AR)、三氯化铝(AR)。

1.3 仪器

DS-T250高速多功能粉碎机(上海市顶帅工贸有限公司)；SHB-III循环水多用真空泵(菏泽市鑫源仪器仪表有限公司)；RE52AA旋转蒸发器(菏泽市鑫源仪器仪表有限公司)； HH-S数显恒温水浴锅(济南启科仪器设备有限公司)；PS-40A超声波清洗机(深圳市超艺达科技有限公司)；754PC紫外-可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 黄酮类成分的分离纯化

取药材洗净，自然风干，粉碎机粉碎后过40目筛，称量270 g。将有柄石韦置于烧杯中用石油醚浸泡过夜。将药液抽滤，向药渣中加入70%浓度的乙醇[4]超声，回流浸提，抽滤得滤液，滤液减压浓缩并回收乙醇，得浸膏。浸膏在水浴锅上蒸干，水溶浸膏并用石油醚多次萃取，下层平均分成9份，待用，水溶后分别用乙酸乙酯、正丁醇、乙醚在不同因素下萃取，分离时各因素水平如下表[5-6]：

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交试验设计及结果分析

将分别用乙酸乙酯、正丁醇、乙醚萃取得到的黄酮提物旋蒸后置于水浴锅上蒸干，称重。

2.2 黄酮类成分的测定

准确称取芦丁对照品3.5 mg，用70%乙醇溶解并定容至50 mL，摇匀得浓度为0.070 0 g/L标准溶液。用该溶液配制十份不同梯度浓度的标准溶液，并显色，用紫外可见光分光光度计在510 nm处测量吸光值。以浓度对吸光度值做标准曲线[7]。，所得黄酮回归方程为，y=6.8302x+0.0052；r=0.9997同样方法测定九份样品提取物的吸光度。由回归方程及稀释的关系计算出每份中黄酮浓度及含量。结果见表2。

3 结 论

3.1 结果分析

由表2可知，4个因素对分离纯化效果影响的主次顺序为萃取溶剂>萃取次数>萃取溶剂用量>萃取时间。萃取溶剂和萃取次数是主要影响因素，萃取时间和每次萃取溶剂的量次之。故应选A2B1C2D2为分离纯化的最佳方案。

3.2 验证试验

根据正交试验结果对A2B1C2D2条件进行3次实验，结果无显著差异。本次试验最佳分离纯化工艺为200 mL的正丁醇萃取4次，每次萃取30 min。

4 讨 论

本研究以中药有柄石韦为研究对象，采用乙醇热回流法提取其中的总黄酮，并用不同的有机溶剂萃取分离，并运用紫外分光光度法在波长510 nm处对黄酮含量进行了测定。通过正交试验法对提取工艺条件进行优化，并进行了验证试验，结果显示最佳提取工艺为200 mL的正丁醇，萃取4次,每次萃取30 min。

研究表明，黄酮类化合物具有抗过敏、降血压、抗炎、抗菌、抗突变、抗溃疡、抗病毒、保肝和降血脂等活性[8]。黄酮作为重要的药效成分在有柄石韦中有着丰富的种类和较高的含量。本研究对有柄石韦中黄酮类成分分离纯化工艺进行优选，以使石韦中黄酮类有效成分能够充分的被人类利用，同时提高了石韦资源的利用率，减少了不必要的浪费，对于建设资源节约型社会具有重大的意义，为进一步对黄酮类成分的理化性质的研究提供有利的条件。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第62卷[M].北京：科学出版社，2000：116.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京：化学工业出版社，2000: 68.

[3] 陈 露，刘布鸣，马军花，等.中药石韦的研究概况[J].广西医学，2011，33(11)：1486-1489.

[4] 邓源喜，李妍，许晖，等.荷叶中黄酮提取及测定方法的研究进展[J].饲料研究，2011(5)：18-20.

[5] 王自军，杨红兵，齐誉，等.正交设计研究石韦总黄酮和鞣质提取工艺[J].时珍国医国药，2007,18(2)：463-464.

[6] 易俗，王瑞兰，谭新中，等.庐山石韦总黄酮的提取工艺初探[J].湘潭师范学院学报，2004,26(1)：76-78.

[7] 马陶陶，张群林，李俊.中药总黄酮的含量测定方法[J]安徽医药，2007,11(11):1030-1032.

[8] Parellade J,Guinea M.Flavonoid inhibitors of typsin and leucine aminopeptidase: A proposed mathematical model for IC50 Estimation[J].J Nat Prod,1995,58(6): 823-829.