东北地区拟南芥室内栽培技术

戚晓利，赵树堂，韩诚武，张丽敏，张海军，申 健，王 波

(1.佳木斯大学 生命科学学院，佳木斯 154007；2.林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院，北京 100091)

拟南芥(Arabidopsisthaliana)属十字花科植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。它具有植株矮小、生长周期短、结籽多、生活力强、基因组小等特点[1]，作为遗传学和分子生物学研究的模式生物之一，尤其在植物发育生物学研究中扮演了十分重要的角色，被国内外许多实验室广泛种植。目前国内很少有实验室具备国外标准化人工气候室，如何在简陋条件下培养成为国内外许多实验室面临的问题。2011年本课题组承担了国家科研院所公益基金合作项目，将胡杨BIBAC文库中的基因大片段转入拟南芥，由于东北地区干燥寒冷的气候特点，拟南芥的培养遇到各种问题，影响科研工作的进展。因此，本研究结合东北地区的实验条件和气候特点，主要在拟南芥的播种方法、温度、光照条件、病虫害防治等方面进行了探索改进，根据实验室栽种的长期实践总结出一套适合东北寒冷气候特点的拟南芥培养方法，供同行参考。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥种子(ArabidopsisthalianaColumbia)由中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室提供、MS培养基、培养基质(营养土∶蛭石=1∶1)、1/2MS营养液。

1.2 方法

土壤育苗法：取育种盘装培养基质(营养土∶蛭石=1∶1)约4 cm厚，加水使土壤充分吸水湿透，取拟南芥种子，直接播撒在土壤表面。播种后覆盖薄膜保湿(薄膜上扎孔利于通气)，放入培养室进行人工光照培养。当2片子叶完全伸展时，去除其上覆盖的薄膜，于2片真叶期移栽。

基质育苗法：将种子消毒后撒播于无菌MS培养基内，光照培养，2片真叶期移栽到培养基质中。

2 结果与分析

2.1 培养方法的比较

培养基质是拟南芥生长中的关键因素，蛭石质地疏松，通气性好，利于幼苗生根。为了保证提供充足的营养与良好的通气透水性，将蛭石、营养土按1∶1的比例混匀[2]。培养基质装盆时，选用干基质要优于湿基质，可避免装盆时培养基质的黏结，保证培养基质的通透性而利于扎根。干基质装入塑料钵后，将塑料盆放入盛有水的平底塑料托盘中，采用底盘吸水法让水分通过毛细管作用由下至上顺着塑料盆底部的小孔自然渗入培养基质中，吸透水后将塑料托盘内多余水倒出，即可进行移栽。幼苗移栽后因环境条件的变化，需经过一定时间的缓苗期才能正常生长。移栽时选择壮苗(株型矮壮，叶色深绿，大小整齐)移栽。土壤育苗法移栽时要多带护根土，避免损伤根系而影响其成活率。基质育苗法移栽时将根部附带的培养基水洗干净再移入培养基质中，每株拟南芥占约5 cm2空间即可。移栽时拟南芥的苗龄对其成活率有很大影响，故要做到适时移栽。最好选择阴天或傍晚时分移栽，移栽后盖膜缓苗2 d，去除薄膜正常培养。

基质培养法与土壤培养法相比较而言，基质培养法保证了出苗的一致性，生长周期略短，缺点是幼苗在移栽到土壤后，对环境的适应性差，前期种子的消毒，培养基的配置要求无菌操作，增加了工作负担。

可根据实验的具体情况择优选择。本课题以转基因为目的实验，转化后需要利用抗生素进行转基因植株筛选，此时优选基质培养法，将作为对照的野生型拟南芥直接移入土壤中培养，既节时又省力。

2.2 播种

拟南芥种子表面甚至内部带有病菌，将直接传给幼苗和成株，造成病害发生，所以播前进行种子消毒对提高播种质量，培育无病灶苗具有重要意义[3]。种子消毒常用方法有药粉拌种、药液浸种。本实验选用转基因植株筛选的种子灭菌法，在超净工作台中将种子至于灭菌的滤纸上，喷洒70%的酒精浸种10 min，喷洒无水酒精，酒精挥发后将一部分种子收集到Eppendorf管中备用，一部分播于MS培养基中作为筛选转基因植株的对照。此方法可避免采用杀菌剂对环境的污染和人体的危害，又与后期转基因筛选实验密切相结合，减少工作量。收获的种子干燥后一般置于4 ℃冰箱内保存，在此条件下保存一个月以上的种子可不必低温处理，直接用于播种[4]。

2.3 培养条件

2.3.1 温度

拟南芥不耐高温，最适温度在(22±2) ℃。温度过高则拟南芥长势弱，生殖期提前，还易引发各种病虫害，温度过低则生长发育周期延长。夏季时期要特别注意避免断电或空调故障而使温度长时间失控。本课题组培养室在4～10月份主要依靠空调控温，黑龙江的冬季(11～3月)室外温度低，主要采取集中供暖，白天室内温度约15 ℃，夜间温度为8 ℃左右，低温对拟南芥的培养提出挑战。试验比较了拟南芥在人工光照(白色荧光灯，16 h光照8 h黑暗，光照强度70 μmol/m2s)条件下二种温度土培拟南芥的生长情况(表1)。由表1可以看出，11～3月份播种的拟南芥植株，始花时间、莲座直径、植株总高、生长周期等指标均高于4～10月份，植株叶片颜色深绿，花序高而粗，植株健壮，果荚大、种子饱满。这是因为气温低，营养生长旺盛，利于培养转化用苗。缺点是生长周期长，延长了实验周期。拟南芥培养温度总体掌握的原则是“宁低勿高”，可以根据不同的试验目的和取材需要，进行分期播种。只要严格掌握春化、播种、育苗、移栽、管理一整套的栽培技术，成活率均可达95%。

表1 拟南芥的生长情况

2.3.2 湿度

拟南芥喜湿润，生长环境的空气相对湿度比较高时有利于拟南芥生长。本培养室的条件达不到其对湿度的要求，保湿方法主要是在地面泼水并不定期喷雾小苗的方法增加湿度。

2.3.3 光照

根据实验的目的调节光照强度和光照时间。拟南芥属长日照植物，光照强度大和光照时间长，可以促进生殖生长，缩短收获种子的时间[5]。植物生长灯均有独立开关，光照强度可通过开关灯管数量控制。本室冬季一般采用16 h光照和8 h黑暗条件培养拟南芥，或者根据需要增加光照时间、光照强度以缩短生长周期。夏季时先将植物置于8 h光照和16 h黑暗的短光照条件下培养(从移苗开始约需4 周)，再移至长光照下诱导开发，以促进植物营养生长。植物转化完后，可在24 h光照条件下培养，促进种子的成熟。光照除选用植物生长灯外，适当补充黄色光源，利于植物生长。

2.3.4 肥水管理

拟南芥耗水强度随生育进程而改变，耗水量以苗期最大，果期最少。浇水原则是“不干不浇，浇则浇透”。切忌过量灌水，避免表层藻类和真菌产生，不利于植株生长，更易招致蝇类、蛆类害虫的产生。

当拟南芥植株叶片深绿色时，表明土壤肥力够；当植株呈现出轻微淡绿色时，表明营养供给不足，应立即施以1/2MS营养液。本实验是在幼苗期、抽苔前分别追施一次1/2MS营养液。

2.3.5 病虫害防治

培养室中拟南芥病虫害的防治是一项长期工作，需要从实际情况出发，根据实验室的环境条件、季节情况、拟南芥的不同生长时期，采用适当的方法进行防治。课题组主要采用严格控制室内温度预防病虫害的发生，利用黄板诱杀果蝇及温室白粉虱。培养基质表面有长绿色青苔现象，通过控制浇水量，放置风扇增加空气流通可以得到有效解决。总体原则是防大于治，将尽可能将病虫害消灭于初发状态。

3 讨 论

拟南芥生长的最适温度一般是(22±2) ℃，光照60～100 μmol/m2s左右较好。但各实验室条件和国内各地的气候条件均不相同。研究发现拟南芥移栽后其生长周期、形态特征会受到光照、温度等外界因素的影响[6]，因此要根据实际情况适时调整培养条件。东北地区冬季漫长，气温低而干燥，不利于拟南芥的生长，夜晚气温持续低温时，拟南芥莲座叶变紫；如果在夏季，室温连续超过28 ℃以上时，拟南芥的营养生长期缩短，抽苔早，花序矮而细弱，不利于基因的转化工作。冬季室内气温低时，可在培养架周围包裹塑料薄膜以保温，通过延长光照时间、增加光照强度等因素而缩短其生长周期；夏季严格控制室内温度，可适当缩短光照周期和光照强度。通过实验室的多年工作实践，本文不仅为研究者提供了东北地区种植拟南芥的资料，而且对拟南芥的种植、管理细节进行了分析。试验表明，在东北地区室内低温条件下完全可种植拟南芥，改进的培养方法能较好地满足研究者的实验需要。

参考文献：

[1] Pruitt R E，Meyerowitz E M.Characterization of the genome ofArabidopsisthaliana[J].Mol Biol，1986，187：169-183.

[2] 赵术珍，毕玉平，拟南芥室内繁种技术的改进[J].山东农业科学，2011(3)：50-51.

[3] 李玲，刘开泉，刘炳福，等.拟南芥培养中病虫害的发生与防治[J].山东农业科学，2010(11)：85-86.

[4] 李俊华，张艳春，徐云远，等.拟南芥室内培养技术[J].植物学通报，2004，21(2)：201-204.

[5] 李玲，刘炳福，刘开泉，等.冬季拟南芥土培室与大棚培养技术的对比研究[J].山东农业科学，2010(10)：55-57.

[6] 王瑜，曾幼玲，黄萍，等.拟南芥在新疆干旱地区的室内栽种及遗传转化[J].生物技术,2008，18(3)：69-71.