红果参叶中总黄酮的提取工艺初步探讨

陈 雅，李 贵，吴帅玲，张永康，陈功锡，*

(1.吉首大学 生物资源与环境科学学院；2.植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000)

红果参系桔梗科(Campanulaceae)金钱豹属(Campanumoea)长叶轮钟草[Campanumoealancifolia(Roxb.) Merr.]的俗称，为湘西苗族传统药用植物，同时由于其叶常绿、花果美丽，又深受人们喜爱，因此可以做观赏植物。该植物为多年生，直立或蔓性草本，茎高可达3 m，肉质根胡萝卜状。《中华本草》记载其有“治疗劳倦气虚乏力、跌打损伤、肠绞痛”等效用。长期以来，湘西苗族人民以其肉质根代替人参作为大病初愈后的滋补品，常称其为“南方人参”。其果实称为“蜘蛛果”、“肉算盘”[1-2]，美味可口，营养丰富，男女老少均喜食用。在春夏生长旺季及冬季，老百姓常采其嫩叶作为蔬菜炒食，不仅风味独特、美味可口，还有一定的保健功效。

黄酮类化合物在植物中广泛存在，并具有多种多样的生物活性。有研究表明黄酮类化合物具有防治神经性病变、延缓衰老[3]、加强DNA的保护[4]、治疗冠心病、抗癌和抗HIV病毒等功效[5]。同时在食品工业上，许多以黄酮类化合物为功能因子的保健食品被开发，如孙建华[6]研制的黄酮绿豆饮料，庞霞[7]研制的富含荷叶黄酮的黄酒，乌毡帽酒业有限公司[8]研制的含有竹叶黄酮的清爽型黄酒等。含有黄酮类物质的药物，保健品越来越受到人们的青睐，其社会需求量大，市场前景广阔，因此从植物中寻找黄酮资源越来越受到人们的重视。红果参全株是宝，果实中含有的化学成分主要有糖类、生物碱、黄酮类、酚类、蒽醌、甾体、三萜类、有机酸等[2]，经实验初步测定红果参叶中含有黄酮，探究红果参叶总黄酮提取工艺，可为红果参的开发利用奠定理论基础，有助于其综合开发利用。

关于黄酮的提取方法多种多样，如热水提取法、酶解法、超滤法、超临界CO2萃取法等[9]，各种提取方法各有特点。本实验采用乙醇超声法提取红果参叶中的总黄酮，相对传统的醇提取法而言，缩短了提取时间，提高了实验效率。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 材料

红果参叶于2011年12月采自湖南省海拔230 m的湘西吉首大学红果参试验基地。采样时，随机摘取红果参的幼叶。采后将叶子迅速洗净、凉干，于60 ℃下烘24 h、粉碎,装袋，密封贮存，备用。

1.1.2 仪器

UV-2550型紫外-可见分光光度仪，日本岛津公司；SHB-3循环水多用真空泵，西安禾普生物仪器有限公司；F2102型微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限责任公司；FA2104N型万分之一电子天平，上海精密科学仪器有限公司；DCTZ-2000型三频多用途恒温超声提取机，北京弘祥隆生物技术有限公司。

1.1.3 试剂

芦丁标准品，中国医药集团上海化学试剂公司；NaNO2、NaOH、Al(NO3)3、C2H5OH，所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准溶液的配制

准确称取芦丁标准品10.6 mg，用体积分数30%的乙醇溶解，并完全移入50mL容量瓶中，用30%乙醇定容[10]，配置成212 mg/L的芦丁溶液。

1.2.2 标准曲线的绘制

取7支试管依次加入质量分数为212 mg/L芦丁溶液0,1,2,3,4,5,6,7 mL，加蒸馏水补充至10 mL，往各试管中加入质量分数5%的NaNO21.5 mL，摇匀，放置6 min后加入质量分数10%的Al(NO3)31.5 mL，6 min后再加入质量分数4%的NaOH溶液20 mL，混匀,20 min后以第一管为空白参比，采用比色法在510 nm波长下测定吸光度[10]。以吸光度为横坐标，芦丁质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 溶剂法提取及含量测定

精确称取1 g干样，在一定条件下用乙醇浸提超声后抽滤，滤液用30%的乙醇定容到50 mL容量瓶中；准确移取4.00 mL于50 mL容量瓶中，用水再次定容。准确移取5.00 mL于锥形瓶中加水5.00 mL，按照1.2.2中所述的方法测定样品中总黄酮提取得率(质量分数)。

黄酮提取得率计算公式：

1.2.4 提取条件优化

1.2.4.1 乙醇浓度的选择

称取干样，在固液比为1∶20，超声提取温度为35 ℃，功率为700 W，超声时间为10 min的条件下，分别用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇进行试验，重复提取3次，计算得率。

1.2.4.2 料液比的选择

称取干样，料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30(g/mL)，于60%的乙醇溶液，在超声提取温度为35 ℃，功率为700 W条件下超声10 min，进行试验，重复提取3次，计算得率。

1.2.4.3 提取时间的选择

称取干样，在料液比1∶10、乙醇浓度为60%，在超声提取温度为35 ℃，功率为700 W的条件下分别超声5、10、15、20、30 min，进行试验，重复提取3次，计算得率。

1.3 多因素正交实验

为寻求最佳工艺提取条件组合，在单因素考察的基础上，选择乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、三个因素为考察因素，每个因素选择3个水平，以总黄酮提取得率为指标，采用了L9(34)正交实验表安排实验，并确立因素水平表，见表1。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

测得芦丁质量浓度Y(μg/mL)及对应的吸光度X，见图1所示。其标准曲线的回归方程为：Y=89.745X-0.019 6；相关系数R2=0.999 9，线性关系良好，可用作红果参叶中总黄酮提取得率的测定。

图1 芦丁标准曲线

2.2 提取条件与得率的关系

2.2.1 乙醇浓度对提取得率的影响

由图2可知，红果参叶中总黄酮在提取时出现两个乙醇浓度峰值，分别为80% 乙醇(5.37%)和50% 乙醇(5.26%)；当乙醇浓度为90%时，黄酮提取得率最低为4.52%；其次为60%、70%，黄酮提取得率依次为4.98%、5.01%；实验结果表明：用80%乙醇提取，黄酮得率可达到最大；另外，50%乙醇作为提取溶剂可有效节约试剂。因此，超声提取的最适乙醇浓度为80%。

2.2.2 提取时间对黄酮提取得率的影响

由图3可知，随超声波处理时间的延长，总黄酮提取率先上升，而后又下降，造成这种现象的原因是在长时间超声作用下，提取率逐渐接近极限，提取物中杂质也随之增加，黄酮提取得率反而降低，由上表分析可知提取时间为10 min、15 min、20 min时黄酮的提取率较高，分别为4.88%、4.90%、4.93%其中提取时间20 min时黄酮提取得率最高。

图2 乙醇浓度对提取率的影响

图3 提取时间对提取率的影响

2.2.3 料液比对提取得率的影响

不同的料液比会对目标成分的提取率产生影响，在一定范围内溶剂量越多越利于目标物浸出，但是过高的溶剂原料比会导致提取得率下降。本实验中在1∶10 到1∶20 的范围内提取得率随料液比增大而增大，在1∶20 到1∶25 的范围内提取得率随料液比增大而减小，在料液比1∶25之后提取得率又开始增大，在料液比为1∶30时黄酮提取得率达到最高值为5.48%，但从总体来看随料液比的增大，总黄酮提取得率增加。

图4 料液比对提取率的影响

2.3 正交实验结果

根据1.3的实验方案开展正交试验设计，所得结果如表2所示。

表2 正交实验设计及结果

在正交实验中，黄酮的提取得率由公式计算而来。通过分析得出红果参叶中黄酮类化合物最佳提取条件为85%的乙醇浓度、提取时间10 min、料液比1∶30。从表2可知：黄酮提取率的影响按大小次序排列分别为RC>RA>RB，即料液比>乙醇浓度>提取时间，初步确定从红果参叶中提取黄酮类物质的较佳方案为：A3B2C3，即最佳提取条件为85%的乙醇浓度、提取时间10 min、料液比1∶30。

2.4 验证性试验

按最佳提取条件85%的乙醇浓度、提取时间10 min、料液比1∶30进行验证试验，设计3组平行试验，取平均值，得最佳工艺下黄酮提取率为4.76%。

3 结 论

该实验初步探究了红果参叶中总黄酮的最佳提取工艺，确定了各因素对红果参叶中总黄酮提取率的影响顺序为C(料液比)>A(乙醇浓度)>B(提取时间) ；最佳提取工艺条件为 85%的乙醇、10 min的提取时间、1∶30的料液比。在此条件下，黄酮类化合物提取率可达4.76%。

从以上初步探究的结果来看，红果参叶中总黄酮含量较高，但是其分离纯化工艺、生理活性等探究工作有待进一步开展。为使红果参叶中的黄酮提取实现工业化生产，可进一步探索红果参叶中总黄酮提取参数，优化生产工艺，为其工业化生产奠定基础。

与桔梗科其他两种最重要的药用植物相比较，党参[11](根)的黄酮提取得率为2.5%，桔梗[12](根部)的黄酮提取得率为2.87%，二者黄酮提取得率都低于红果参的叶。此外，檀香叶[13]中总黄酮提取得率可达3.24%，黄皮[14]叶中的可达3.62%，紫苏[15]叶中的可达4.03%，银杏[16]中的可达5.14%，红果参叶中总黄酮的含量较紫苏、黄皮、檀香叶中的高，稍低于银杏叶。可见，红果参叶中的黄酮含量丰富，可能具有更高的开发利用价值。

参考文献：

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