法舒地尔对大鼠肺动脉平滑肌细胞收缩、迁移能力的影响1)

2014-03-29 11:24褚银平刘爱军程金莲高奇英
中西医结合心脑血管病杂志 2014年7期
关键词:舒地尔小室胶原

褚银平,刘爱军,程金莲,张 栋,高奇英,张 羽

肺动脉高压(PAH)是以肺血管阻力进行性增高为临床特征的一组疾病,其发生发展最终导致右心室肥厚,右心功能衰竭。肺动脉高压的病理变化主要是肺血管收缩和重构,其中肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)由收缩型向合成型转化,从中膜向内膜发生迁移并过度增殖是肺血管重构的关键环节[1-3]。因此,抑制PASMCs收缩、迁移及增殖对于肺动脉高压的治疗具有重要意义。近年来有较多的动物实验研究结果显示,Rho激酶(ROCK)的选择性抑制剂法舒地尔对肺动脉高压具有潜在的治疗作用。体外细胞实验表明,法舒地尔对PASMCs的增殖具有抑制作用,这可能是其阻遏、逆转肺动脉高压的机制之一,然而,法舒地尔对PASMCs收缩及迁移能力的影响如何,目前尚无明确的实验研究予以报道。因此,本研究旨在探讨法舒地尔对体外培养的PASMCs收缩、迁移能力的影响,以进一步阐明其抗肺动脉高压的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 胎牛血清(FBS)和DMEM培养液购自美国HyClone公司,法舒地尔购自天津红日药业股份有限公司,胶原收缩试剂盒购自美国Cell Biolabs公司,Boyden Chamber迁移小室购自美国BD公司。

1.2 细胞培养及分组 采用组织块贴壁法分离培养大鼠PASMCs,选取体重250 g~300 g,雄性SD大鼠,麻醉后于无菌条件下分离肺动脉,仔细剥除外膜1 mm3的纤维脂肪层及内皮细胞,用眼科剪将肺动脉中膜剪成约1 mm3的组织块,接种于培养瓶中,用含有15%FBS的DMEM培养液,于37℃,5%CO2培养箱中静置培养。当大部分组织块长出细胞晕,吸弃培养液和组织块,胰酶消化混匀细胞,进行传代培养。采用α-肌动蛋白免疫细胞化学染色法对PASMCs纯度进行鉴定,选用(4~6)代生长良好,纯度98%以上的PASMCs细胞进行实验,当其生长达到80%~90%融合后,换无血清培养液静息培养24 h使细胞周期同步化,胰酶消化混悬后,以一定浓度接种于细胞培养板中。细胞随机分为正常培养对照组和不同浓度法舒地尔处理组(10μmol/L,30μmol/L,50μmol/L),作用不同时间后分别进行不同的生物学检测。

1.3 胶原凝胶法检测大鼠PASMCs收缩 取处于对数生长期的PASMCSs,饥饿培养使细胞同步化后,胰酶消化混匀,计数,配成3×106个/L的细胞混悬液,按1∶4比例将细胞悬液与冷的胶原溶液配成细胞-胶原混合物。于24孔板每孔中加入0.5 m L细胞-胶原混合物,37℃,5%CO2培养箱中孵育1 h,当胶原凝集成型后,于其上加入1 m LDMEM细胞培养液。孵育2 d后,胶原中形成了足够的张力,于不同的孔中分别加入不同终浓度的法舒地尔,用灭菌小铲将胶原从培养皿底面撬起以使其自由收缩,分别培养不同时间(24 h,48 h)后,扫描仪记录胶原面积大小,采用Quantity One图像分析软件分析胶原面积。

1.4 Boyden Chamber法检测大鼠PASMCs迁移 采用Boyden Chamber迁移小室测定PASMCs的迁移能力,该小室底面为均匀分布有直径8μm孔洞的聚酯薄膜(PET膜)。取对数生长期的PASMCs,饥饿培养使细胞同步化后,用含0.1%FBS的DMEM制备成浓度为5×105个/L的细胞混悬液,取300μL混悬液加入Boyden Chamber小室的上室,于下室加入500μL含1%FBS的DMEM,上下室中均加入不同终浓度(10μmol/L,30 μmol/L,50μmol/L)的法舒地尔。37℃,5%CO2培养箱中培养12 h后,将小室取出,90%酒精常温固定30 min,0.1%结晶紫常温染色10 min,清水漂净,用棉签除膜上侧面未迁移的细胞,PBS清洗后,10%乙酸100μL,抽提10 min,于560 nm处测定OD值。

1.5 统计学处理 所有实验均重复3次,计量资料以均数±标准差(±s)表示,应用SPSSS 13.0软件分析,比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 法舒地尔对大鼠PASMCs收缩胶原能力的影响 胶原凝胶细胞收缩分析结果表明,PASMCs培养24 h、48 h后,与对照组相对比,法舒地尔处理组PASMCs收缩胶原能力显著降低(P<0.01),并呈浓度依赖性,法舒地尔浓度为50μmol/L,处理时间48 h时,对PASMCs收缩胶原能力的抑制达到最大(见图1、图2)。

图1 PASMCs-胶原混合结构面积大小

图2 法舒地尔对PASMCs收缩胶原能力的影响

2.2 法舒地尔对大鼠PASMCs迁移能力的影响 Boyden Chamber迁移小室法分析结果表明,PASMCs培养12 h后,与对照组相对比,法舒地尔处理组PASMCs的胶原收缩能力,显著降低(P<0.01),并呈浓度依赖性,当法舒地尔浓度为50 μmol/L对PASMCs胶原收缩能力的抑制达到最大(见图3)。

图3 法舒地尔对PASMCs迁移能力的影响

3 讨 论

肺动脉高压的主要表现是肺血管阻力增加,肺血管重构,原位血栓形成,最终导致右心室肥厚,右心功能衰竭,肺血管重构是主要的病理变化特征。平滑肌细胞是肺动脉的主要细胞成分之一,其向收缩表型的转化、过度迁移及增殖导致中膜增厚、无肌细动脉肌化、管腔狭窄,是肺血管重构和肺动脉高压的重要原因。因此,抑制PASMCs的收缩和迁移,可能对于肺动脉高压的治疗具有重要意义。法舒地尔最初被用于改善和预防蛛网膜下腔出血后脑痉挛及其引起的脑缺血症状,是目前临床使用的唯一一种选择性ROCK抑制剂,ROCK激酶的活化,对于平滑肌细胞的一系列细胞生物学功能,包括收缩、迁移、增殖及基因表达等均具有重要调节作用[4,5]。法舒地尔具有潜在的抗肺动脉高压作用。长期应用法舒地尔能够降低野百合碱所致大鼠肺动脉高压,减轻右心室肥大程度,同时可抑制血管平滑肌增殖,减少巨噬细胞浸润,促进血管内皮细胞凋亡,改善肺血管壁重构[6]。法舒地尔对高血流量引起的小鼠肺动脉高压及血管重构具有抑制作用[7]。法舒地尔对于重度肺动脉高压患者可以起到迅速舒张肺血管的作用[8]。尽管已有较多体内研究证据显示,法舒地尔具有潜在的抗肺动脉高压作用,但其细胞水平上的作用机制如何,目前的研究还很不充分。本课题组在前期研究中,通过体外细胞实验证明,法舒地尔能够通过上调p27 Kip1蛋白表达抑制血小板衍生生长因子诱导的PASMCs的增殖[9],而法舒地尔对PASMCs收缩及迁移的影响作用,尚不完全清楚。

本研究采用体外分离培养大鼠PASMCs,在细胞水平上探讨法舒地尔对PASMCs收缩及迁移能力的影响。胶原凝胶收缩实验证明,法舒地尔对PASMCs收缩胶原的能力有显著的抑制作用,并具有浓度依赖性,当法舒地尔浓度为50μmol/L,处理时间为48 h时,其抑制作用达到最大。此外,Boyden Chamber法检测结果还显示,法舒地尔对PASMCs胶原收缩能力也有显著抑制作用。本研究结果表明,法舒地尔可以显著抑制PASMCs的收缩和迁移能力,这可能是法舒地尔抗肺动脉高压的又一重要机制。

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