顾志良教授农业动物分子遗传学研究综述

郁建锋，邵 芳

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

动物的肌肉生长、脂类代谢和脂肪组织的形成都是科学家备受关注的重要问题.特别是在农业动物中，肌肉生长发育和体内脂类代谢的调控在畜牧生产和育种中显得尤为重要.十多年来，顾志良教授围绕农业动物的重要经济性状候选功能基因的克隆和多态性、基因表达调控机制和分子进化等方面开展了研究，下面简要综述一下他的相关研究工作.

1 家禽肌肉发育和脂类代谢相关功能基因的研究

1.1 Myostatin基因的研究

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）作为骨骼肌生长发育的负调节因子而倍受关注，研究MSTN基因的结构和功能对阐明骨骼肌生长发育的调控具有重要意义.顾志良教授较早地对鸡的MSTN基因开展了研究，用PCR-SSCP和DNA测序的方法发现了5个位于鸡MSTN基因5′和3′侧翼区的单核苷酸多态性位点，并对9个不同鸡种的该基因单核苷酸多态性进行分析，并在四个区段发现了多态性.不同鸡种群体遗传学分析表明，5′调控区引物P60/P61扩增片段多态性位点在北京油鸡的基因型频率分布与其他品种有很大的差异；对于引物P93/P94，品种间的基因型频率差异极显著（P<0.01），北京油鸡和AA鸡的EE型频率低于其他品种，白耳鸡和海兰蛋鸡中以EE型为主；3′调控区引物P80/P81多态性位点在9个鸡种中都是等位基因C占优势.引物P76/P77，总体上MM型的频率较低，杂合子MN型的频率较高[1].在CAU资源家系，发现12周龄AA型腹脂重显著高于BB型（P<0.05），AA和AB型腹脂率显著高于BB型（P<0.05），AA型的胸肌率显著高于AB型，EF型比EE型的高；CC型的胸肌重显著高于DD型（P<0.05），CC型的胸肌率显著高于CD型（P<0.05），极显著高于DD型（P<0.01）.5′调控区是基因表达的重要部位，存在着很多的转录因子的结合部位，而MSTN基因这个区域的单核苷酸多态性的变化可能影响到了某个或某些转录因子与其结合，从而导致了MSTN基因的转录表达水平发生变化，进而出现生产性能的差异.从实验的结果可以看出鸡MSTN基因的这些多态位点与鸡的胸肌重和胸肌率的显著相关性.与鸡腹脂重及腹脂率的相关性证明MSTN在脂肪形成与沉积中可能起着重要作用；也有可能是通过体内能量代谢或调节其他细胞如肌细胞或神经细胞分泌其他细胞因子间接影响脂肪在体内的代谢与沉积[2].

在江苏省高校自然科学研究计划的支持下，对鹅MSTN基因进行了研究.克隆了长约为1.3 kb的鹅MSTN基因的5′调控区，分析确定了其启动子和转录起始位点，发现在转录起始位点上游-34 bp处存在1个TATA盒，-77 bp处存在1个CAAT盒.还发现在该片段中包含多个肌肉特异性转录因子结合位点.用Northern blot方法检测到鹅MSTN基因mRNA只在胸肌和腿肌中表达，具有组织特异性.同时在鹅的MSTN基因5′调控区（启动子部分）的单核苷酸多态分析发现了2个多态位点，其中一个多态位点正好位于CF/LEF-1的结合区，另一个位于内含子1上[3-5].检测了鹅MSTN基因的单核苷酸多态性，并对10个不同品种（系）鹅单核苷酸多态性进行了群体遗传分析.发现3对引物的扩增片段都具有多态性[5].不同鹅品种（系）群体遗传学分析表明，启动子区域引物P3扩增片段多态性位点在各群体中等位基因A的频率均高于等位基因B，且基因频率均高于0.77，表现为优势基因；引物P4扩增片段多态性位点在扬州鹅、朗德鹅、狮头鹅群体中等位基因D的频率均高于等位基因C的频率，在其余群体中均表现为等位基因C的频率高于等位基因D的频率[5].分析了鹅的MSTN基因的单核苷酸多态性与生产系性能的相关性[6].

1.2 鸭脂联素基因的研究

脂联素是一种脂肪细胞表达的细胞因子，它与胰岛素抵抗、动脉粥样硬化之间的相关性被许多研究者所关注.在江苏省自然科学基金的支持下，课题组开展了鸭脂联素的基因克隆和功能研究.获得了鸭脂联素基因1374 bp全长cDNA序列，编码245个氨基酸；该基因在进化过程中具有一定的保守性.研究表明脂联素基因在所测组织中均表达，且高度表达于脂肪、肌胃、小肠、心和骨骼肌组织.成功构建鸭脂联素融合蛋白表达载体pET41a-duck-adp，重组表达质粒转入大肠杆菌中表达，获得了30 KD的鸭脂联素原核表达蛋白[7].还以8个鸭品种为实验材料，检测鸭脂联素基因的单核苷酸多态性，发现有7个单碱基突变.鸭群中表现出AA、AB、AC、BB、BC、CC、DD、DE 8种基因型.8种基因型在品种间分布存在极显著的差异（P<0.01）.除金定鸭外，其他品种均处于Hardy-Weinberg平衡状态.群体遗传分析表明金定鸭的纯合度最高，高邮鸭最低，其他各群体的纯合度较相近；金定鸭为低度多态，高邮鸭为高度多态，其他品种为中度多态.不同基因型的腹脂等屠宰性状进行方差分析，昆山麻鸭的AA型皮脂重和皮脂率显著高于AC；樱桃谷鸭的BC型皮脂率、腹脂重、腹脂率显著高于AC、CC型.研究表明脂联素基因可能是影响鸭脂肪代谢的主效基因或与控制该性状的主效基因连锁[8-9].

1.3 鸡瘦素受体基因的研究

OBR在Leptin的信号转导中起着极其重要的作用，与脂肪沉积和体重有关，因此可以把OBR基因作为研究脂肪沉积的候选基因.以高脂系（FL）、低脂系（LL）以及北京油鸡、白耳鸡、石歧杂、隐性白羽鸡和海兰蛋鸡等为研究对象，用PCR-SSCP结合序列测序对OBR基因的外显子9的序列多态性进行了研究，结果发现存在三种基因型.通过独立性检验发现基因型频率分布与品种有关，高低脂系间的基因频率有显著差异，初步认为鸡的OBR是影响脂肪沉积性状的重要候选基因之一[10].进一步还在OBR内含子8序列中发现了3种基因型，发现不同基因型在腹脂重和腹脂率上差异显著，BB型个体的腹脂重和腹脂率显著高于AB型，极显著高于AA型，且AA型个体的肝重显著低于另外两种基因型.由此可见，OBR基因核苷酸变异影响了鸡腹脂沉积及肝重，因此多态位点也可以作为鸡的脂肪性状的辅助分子标记，在鸡的育种实践中有着重要意义[11].

1.4 鸭Cav-1，3基因的研究

首次克隆了鸭Cav-1，3基因的全长cDNA序列，分别获得了2603 bp和1066 bp的全长cDNA.实时荧光定量PCR证实鸭Cav-1和Cav-3基因在所检测的12个组织中均有表达且心肌中表达量最高.利用PCR-SSCP方法对金定鸭、巢湖鸭、樱桃谷鸭和高邮鸭四个品种Cav-1，3基因进行单核苷酸多态性研究，在Cav-3基因第2外显子上检测到5个单碱基突变，其中2个突变在编码区，为同义突变，其余3个突变位于3′-UTR区.这使所检测的4个鸭品种共呈现6种基因型，6种基因型在各个鸭品种中分布差异明显.在Cav-3基因内含子上检测到1个碱基突变，这使所检测的4个鸭品种共呈现3种基因型，3种基因型在各个鸭品种中分布差异明显[12].

2 畜禽miRNA的克隆及功能研究

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码小RNA，miRNA主要作用于靶基因mRNA的3′-UTR区，抑制目标mRNA的翻译或者引起目标mRNA降解，在转录后水平调控基因的表达，其广泛地参与了生物的发育、分化、细胞凋亡、肿瘤的发生等各种生理代谢途径[13].我们对农业动物的重要生产性状相关miRNA的表达、作用靶点和调节机制作了相关的研究.

2.1 牛脂肪和乳腺组织miRNA的识别和特征

在国外博士后研究期间，构建了牛的脂肪和乳腺这两个组织的小RNA的cDNA文库.在牛的脂肪组织小RNA文库获得了154个序列，在乳腺的小RNA文库中获得了104个序列.miRNA数据库的比对分析表明在脂肪质和乳腺组织分别有133个和96个miRNA.这229个牛miRNA进一步聚类为54个唯一的miRNA，23个来自脂肪组织，39个来自乳腺组织.鉴定了牛的59个miRNA，其中5个全新的miRNA.采用核酸酶保护试验分析了部分miRNA在牛组织的表达情况，结果显示miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-143在乳腺中的表达明显高于其他组织，推断它们在乳腺组织的发育和生理方面具有重要作用.与其他物种有所不同的是miRNA-133除了在骨骼肌和心肌中表达以外，在瘤胃中也有表达，说明miRNA-133在反刍动物所特有的瘤胃的生长发育和生理方面存在调控作用[14].这是国际上对牛的miRNA研究的最早报道之一.

2.2 鸡的miRNA的研究

在国家自然科学基金的支持下，从2008年开始我们开展了鸡的脂肪、肌肉组织中小RNA的筛选、表达和功能研究工作.构建了AA鸡脂肪和肌肉两个组织小RNA文库，从鸡的脂肪和骨骼肌鉴定了47个miR⁃NA，其中包括4个与其他物种具有同源性而在鸡中未发现的，还有5个潜在新miRNA，这为弄清鸡的脂肪形成、沉积和肌肉的生长等有关基因转录后的miRNA调控机制奠定了坚实的基础.利用生物信息学方法预测了两个组织中所克隆的miRNA在脂肪和肌肉组织中的靶基因，发现一些基因可能会受到不至一个miRNA的作用.相反有些基因被同一个miRNA调控.采用TaqMan MicroRNA技术在鸡的12个不同组织、不同日龄分析了 miRNA-23a、miRNA-22、miRNA-133a、miRNA-122、miRNA-199、miRNA-1a、miRNA-126、miRNA-200b、miRNA-145和miRNA-191的表达情况[15].

后续开展了miR-133a、miR-126、miR-33、miR-122等miRNAs在鸡的肌肉发育与脂类代谢方面的功能研究.其中运用双荧光素酶和种子区突变实验证明miR-133a能靶定与细胞增殖有关的基因BIRC5，为研究miR-133a调控鸡骨骼肌的形成和发育的机制既提供了重要的数据又奠定了基础.还验证CNPB为miR-1a的靶基因，揭示了鸡miR-1a在肌肉中的重要作用[16].验证了Spred1是miR-126靶基因.在miR-126的组织表达分析中发现其在肺中的表达量明显高于其他组织，miR-126在从0至7周肝脏组织中表达量呈不断升高的趋势，推断miR-126在鸡的肝脏的发育阶段中比早期形成阶段发挥着更重要的作用.在离体的鸡肝细胞体外培养过程中发现miR-126的表达量快速下降，2天之后降至2.7%，这可能与肝细胞在体外培养过程中去分化重新进入细胞周期循环有关，暗示miR-126可以负调控Spred1而活化Ras-MAPK信号通路，从而促进细胞的生长、分化[17].同样运用生物信息手段发现，miR-33是定位于SREBP基因内含子的miRNA，能负向调控FTO基因表达.鸡原代肝细胞转染LNA-anti-miR-33后，miR-33的表达量下降，而miR-33的预测靶基因FTO的表达量有一定程度的上升，进一步证明FTO基因为miR-33的靶基因[18].此外，还发现miR-33能调控跟肝脏脂肪酸的氧化相关的酶基因CROT、HADHB基因的表达，参与调控鸡肝脏中脂肪酸的合成和氧化，进一步影响脂肪组织的沉积[19].

3 动物生长激素(GH)调节功能的机理研究

动物生长是一个复杂的生物代谢过程，受基因型、激素、营养和环境等多方面的影响.生长轴是动物体内从下丘脑-垂体-靶器官的一系列激素及其受体所组成的神经内分泌系统.生长激素（GH）通过IGF-I介导调节动物生长和细胞分化，通过提高生长轴中GH和IGF-I水平，促进增重、提高饲料转化率和改善肉品质，是畜禽生长调控的一种新途径[20-22].在国家自然科学基金项目的支持下，开展了GH调控鸡IGF-I基因分子机制的研究.

GH诱导JAK2-STAT5通路相关基因表达的研究主要集中在哺乳动物上.研究了GH对原代鸡肝细胞中表达并参与GH/IGF-Ⅰ信号通路的相关基因表达的影响.发现GH处理6 h后IGF-I的表达极显著的高于对照组（P<0.01）；这种表达差异水平的现象持续至18 h；而24 h时其相对表达量有所下降，但仍显著高于对照组（P<0.05）.肝脏富含因子（HNF-1α、HNF-1β、HNF-3β）在鸡肝细胞中都有很高的表达，但是GH处理后，其表达量与实验组相比都无显著性变化（P>0.05）.这些结果说明GH调控IGF-I基因的表达不通过HNF因子间接介导，这与哺乳动物存在明显不同[23].GH可以通过STAT5b的介导促进哺乳动物IGF-I基因的表达.研究鸡IGF-I基因及其上下游侧翼序列上起增强子作用的STAT5b结合位点，试图弄清GH调控鸡的IGF-I基因表达的分子机理.利用VISTA程序对鸡IGF-I基因（NW_001471513）及其上下游侧翼端的STAT5b结合位点进行分析.发现了在鸡IGF-I基因约50 kb和其5′侧翼序列约40 kb以及其3′侧翼序列约10 kb共约100 kb序列上共含有57个STAT5b结合位点（TTCNNNGAA），按其顺序被命名为S1～n；与人类相应序列对比，在其保守区域共有两个STAT5b结合位点（S26和S31），其保守性大于70%.首先通过基因重组技术将57个STAT5b结合位点分别克隆到荧光素酶报告基因载体上；然后通过体外细胞培养体系和双荧光素酶报告基因检测试验，找出能够介导GH促进报告基因表达的位点，进一步研究IGF-I基因及其侧翼端序列上57个STAT5b结合位点中起增强子作用的位点.除保守位点S26外，还有S15、S19、S36和S53结合位点能够介导GH促进报告基因荧光素酶表达量的增加；在GH刺激下能够促进报告基因荧光素酶表达量极显著增加（P<0.01），而且位点突变以后，荧光素酶表达量显著降低，基本恢复本底水平.通过EMSA证明了其中几个位点确实能跟含有STAT5b的核蛋白发生结合[24].

4 农业动物遗传多样性和分子进化的研究

近年来，顾志良教授除了前面提到的对家禽功能基因的单核苷酸多态性在不同品种中的检测和群体遗传多样性研究外，还对猪不同品种的线粒体多样性和家猪起源、牦牛线粒体全基因组序列分析和反刍动物进化及禽类myostain基因的进化等开展了研究.

在博士后期间，通过对我国60多个地方猪种和部分引进品种的线粒体D-Loop区和CytB基因序列的分析，初步确定了我国不同地方猪种之间的进化关系[25].测定了牦牛的线粒体基因组全序列，发现牦牛的线粒体基因组在基因组织结构上与牛相同，发现D-loop区的保守区的保守性反而低于其周围区域，采用22个tRNA串联基因序列与12SrRNA和16SrRNA基因序列，分别构建反刍动物的进化树，根据线粒体的12SrRNA和16SrRNA基因牦牛和其他反刍动物的分类关系进行了分析，估计了牦牛与普通牛/瘤牛，牦牛和水牛的分化分别发生在4.38到5.32，10.54到13.85百万年前.这一结果与古生物学的证据一致[26].

通过克隆的鸭、鹅、鹌鹑、家鸽等几种禽类的MSTN基因，并结合GenBank中的其他物种的序列，用禽类的MSTN的氨基酸序列构建N-J系统发生树，发现已知的物种间MSTN基因之间非常保守，暗示着它们的结构和功能非常保守[4].系统发生树将MSTN基因分成哺乳动物、鸟类和鱼类.在每个群体中平均非同义距离dN和同义距离dS，三个群体的平均dN明显比平均dS小，非常有趣的是平均dS在哺乳动物和鸟类两组相似，而平均dN在鸟类显著小于哺乳类，这暗示着鸟类的选择约束强于哺乳类，鸟类的MSTN基因的功能非常保守，我们知道不同的氨基酸有不同的生物学功能，检测这些位点的进化压力，与成对比较结果相一致[4].

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