维生素C对中华蜜蜂幼虫发育及工蜂生存能力的影响

韩 旭 田柳青 王子龙 颜伟玉 曾志将 吴小波

蜜蜂是一种变态发育的社会性昆虫，需经历卵、幼虫、蛹和成蜂4个阶段［1］。在正常条件下，由3～12日龄的哺育蜂为蜜蜂幼虫提供蜂王浆或蜂粮等食物，满足其对各种营养物质的需求［2］。成年蜜蜂在不同环境、日龄及劳动分工中，所需的营养差异很大。然而，充足均衡的营养对蜜蜂正常的生长发育和代谢有着重要意义。维生素C是一种水溶性的抗氧化剂，在生物体的有氧代谢过程中能够保护机体免于氧化剂的威胁，在机体的抗氧化过程中发挥着重要的作用［3］。维生素C作为自由基清除剂，能与超氧阴离子自由基(O2－·)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)结合，生成抗坏血酸自由基，同时它也可以清除单线态氧，从而保护机体免受内源性氧自由基的损伤［4］。维生素C也是蜜蜂生长发育、繁殖以及维持正常的生命活动不可或缺的营养物质［5］。研究表明，维生素C是蜜蜂机体内重要的抗氧化因子，具有极强的抗氧化能力，是蜜蜂维持正常生命特征的重要保障。早在1990年，刘富海［6］的研究就表明，在蜜蜂饲粮中添加适量的维生素C可延长蜜蜂的寿命。维生素C也能有效刺激蜜蜂取食并对幼虫及成蜂腺体发育有促进作用［7］。

超氧化物歧化酶(SOD)是一类广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，根据活性中心结合的金属离子不同，可以分为铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)3类［8］，它们通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，进而减轻或消除机体代谢过程中产生的过多的超氧阴离子自由基，在预防疾病、提高机体免疫力以及抗衰老、抗炎症等方面发挥重要的作用［9］。研究表明，中华蜜蜂Cu/Zn-SOD基因在不同发育时期和不同部位均有表达特异性，而且在6日龄幼虫中的表达量达到峰值，而在4日龄蛹中的表达量最低;头部与腹部的表达量显著高于胸部［10］。2013年，刘俊峰等［11］通过给刚出房的中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂饲喂不同浓度的维生素C，发现随着维生素C浓度的升高，10日龄中华蜜蜂的死亡率显著下降，Cu/Zn-SOD基因相对表达量也呈下降趋势，但差异不显著。然而，其试验组只设计了2种浓度的维生素C，饲喂高浓度维生素C对蜜蜂生存能力的影响未见报道。鉴于此，本试验拟在总结前人试验的基础上，进一步开展维生素C对中华蜜蜂幼虫发育及工蜂生存能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中华蜜蜂。

1.2 主要试剂

Trizol总RNA提取试剂盒、RNA酶抑制剂购自全式金公司，M-MLV反转录酶及SYBR GreenⅡ荧光定量试剂购自TaKaRa公司，维生素 C(25 g，浓度在99.0%以上)购自Sigma公司。

1.3 主要仪器

主要仪器有24孔细胞培养板(赛业生物科技公司)、生化培养箱(GZ－250－GSI型，韶关市广智科技设备发展有限公司)、普通离心机(飞鸽KA－1000型，上海安亭科学仪器厂公司)、台式冷冻离心机(5810R型，Eppendorf公司)、PCR仪(iQ TM2型，Bio-Rad公司)。

1.4 试验设计

1.4.1 蜜蜂幼虫饲养试验

将800只1日龄中华蜜蜂幼虫随机分为5组，每组8个重复，每个重复20只。其中，对照组(Ⅰ组)饲喂基础饲粮(表1)，基础饲粮中维生素C含量为1.6 mg/kg;4个试验组分别饲喂在基础饲粮中添 加 10(Ⅱ 组)、20(Ⅲ 组)、30(Ⅳ 组)、40 mg/kg(Ⅴ组)维生素C的试验饲粮，对应的试验饲粮中维生素 C 含量分别为 11.6、21.6、31.6、41.6 mg/kg。由于维生素C性质不稳定，容易被氧化分解，每天的饲粮现配现用。

表1 中华蜜蜂幼虫基础饲粮组成Table 1 Basal diet composition of larvae for Apis cerana cerana

1.4.2 工蜂饲养试验

选取4群群势相同的中华蜜蜂蜂群，隔王产卵，将即将出房的封盖子放入恒温恒湿(34℃，相对湿度为75%)的培养箱中羽化。将羽化出的1日龄中华蜜蜂工蜂分成4组，每组6个重复，每个重复24 g(约300只)。其中，对照组(Ⅵ组)饲喂1∶1(蔗糖与水的质量比)的糖水，3个试验组分别在1∶1的糖水中添加 50(Ⅶ组)、500(Ⅷ组)、2 500 mg/kg(Ⅸ组)的维生素C。各组糖水现用现配。

1.4.3 蜜蜂幼虫饲养方法

用蒸馏水反复冲洗24孔细胞培养板，然后用70%乙醇溶液消毒，再将培养板放于超净工作台中，打开紫外照射灯，通风干燥5 h。将200μL幼虫饲粮加入到培养板的每个孔中，并置于34℃培养箱中预热5 min。再用移虫针将1日龄幼虫从巢脾中移出，放入盛有营养液的培养板的孔内，每孔2～4只，使幼虫漂浮在营养液表面。移虫完成后，将培养板放入恒温恒湿(34℃，相对湿度为95%)的培养箱中，避光培养。每12 h更换1次食物。每次饲喂300 mg幼虫饲粮。第2天之后，饲养密度降低至1只幼虫/孔。7～8日龄时能在培养板的孔底部看到尿素晶体和纤维状物质，说明幼虫开始排便，准备化蛹，此时，将大幼虫转移至化蛹培养板，并放入恒温恒湿(34℃，相对湿度为75%)的培养箱中，避光培养，直至蜜蜂出房。此期间是蜜蜂发育的敏感时期，避免移动化蛹培养板。

1.4.4 工蜂饲养方法

将1日龄工蜂以重复为单位随机放入小木箱(11 cm×13 cm×15 cm)中，将小木箱放入恒温恒湿(34℃，相对湿度为65%)的培养箱中继续饲养。为避免应激干扰带来的影响，首次饲喂24 h后取出已死亡的蜜蜂，开始正式试验。在前3天试验中给予充足花粉，补充发育所需的营养。另外，每24 h更换1次食物，并记录和清除已死亡的蜜蜂，直到蜜蜂全部死亡。

1.5 样品采集

1.5.1 蜜蜂幼虫饲养试验

从每组的8个重复中各任意选出4个重复，每重复随机选取发育正常的6日龄幼虫、3日龄蛹以及刚羽化蜜蜂(1日龄成蜂)各5只，准确称重，计算其均值(幼虫需用蒸馏水冲洗掉体表蜂王浆并用吸水纸擦干)。另外，从剩余的4个重复中，每重复随机选取6日龄幼虫、3日龄蛹以及刚羽化蜜蜂各3只，立即放入液氮速冻，－80℃保存，用于Cu/Zn-SOD基因相对表达量的测定。

1.5.2 工蜂笼养试验

在各重复中选择3个重复进行采样，不参与生存率的记录和分析。每重复随机采集3、9、15日龄工蜂各4只，以4只工蜂头部作为1个样品，取样后立即放入液氮速冻，－80℃保存，用于Cu/Zn-SOD基因相对表达量的测定。

1.6 Cu/Zn-SOD基因相对表达量的测定

用Trizol总RNA提取试剂盒进行样品总RNA的提取。所有操作均按照试剂盒说明书进行。将提取的总RNA溶于30μL RNA-free的焦磷酸二乙酯(DEPC)水中，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测后，放入－80℃保存。

用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，反应体系为50μL:8μL总RNA，10μL Buffer，8μL dNTP，1.5 μL M-MLV 反转录酶，3 μL Oligo dT，1 μL RNA酶抑制剂，18.5μL DEPC水。反转录反应条件如下:体系混匀后，42℃反应60 min，75℃反应5 min。反转录产物稀释10倍后保存于－80℃。

采用DNAMAN 5.0设计引物，引物序列见表2。实时定量PCR(RT-qPCR)反应体系为10μL:1μL反转录产物，目的基因的上游和下游引物各0.4μL，5 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，3.2 μL ddH2O。PCR 扩增程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃ 10 s，58.9 ℃1 min，40个循环;最后以每5 s上升0.5℃的速度从61℃升到95℃，记录熔解曲线，每个反转录样品重复测定3次。反应结束后收集目的基因与内参基因的循环数(Ct)值，用qPCR package的R软件计算扩增效率，参考文献［12］的方法计算目的基因的相对表达量。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.7 统计分析

采用SPSS 17.0软件对试验数据进行Kaplan-Meier法的生存分析，采用StatView软件“ANOVA and t-test”中的“ANOVA or ANCOVA”进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 维生素C对中华蜜蜂幼虫发育的影响

2.1.1 维生素C对中华蜜蜂幼虫体重的影响

2.1.1.1 6 日龄幼虫体重

由图1可知，6日龄幼虫的体重随着饲粮中维生素C含量的增加先增加后降低，具体表现为Ⅱ和Ⅲ组显著高于对照组(P＜0.05)，且Ⅱ和Ⅲ组还显著高于Ⅴ组(P＜0.05)，但Ⅱ和Ⅲ组之间差异不显著(P＞0.05)。

图1 维生素C对6日龄幼虫体重的影响Fig.1 Effects of vitamin C on body weight of 6-day-old larvae

2.1.1.2 3 日龄蛹体重

由图2可知，3日龄蛹的体重随着饲粮中维生素C含量的增加先增加后降低，具体表现为Ⅱ和Ⅲ组均显著高于对照组(P＜0.05)，且Ⅱ和Ⅲ组还显著高于Ⅳ和Ⅴ组(P＜0.05)，但Ⅱ和Ⅲ组之间差异不显著(P＞0.05)。

图2 维生素C对3日龄蛹体重的影响Fig.2 Effects of vitamin C on body weight of 3-day-old pupae

2.1.1.3 刚羽化蜜蜂体重

由图3可知，刚羽化蜜蜂体重随着饲粮中维生素C含量的增加先增加后降低，具体表现为Ⅱ和Ⅲ组显著高于对照组及Ⅳ和Ⅴ组(P＜0.05)，但Ⅱ和Ⅲ组之间差异不显著(P＞0.05)。

2.1.2 维生素 C对中华蜜蜂幼虫化蛹率和羽化率的影响

由图4可知，中华蜜蜂幼虫化蛹率及羽化率随着饲粮中维生素C含量的增加均先上升后下降。在化蛹率方面，Ⅱ和Ⅲ组显著高于对照组及Ⅳ和Ⅴ组(P＜0.05)，而Ⅱ和Ⅲ组之间差异不显著(P＞0.05)。在羽化率方面，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组显著高于对照组和Ⅴ组(P＜0.05)，但Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组之间差异不显著(P＞0.05)。

图3 维生素C对刚羽化蜜蜂体重的影响Fig.3 Effects of vitamin C on body weight of new emerged bees

图4 维生素C对中华蜜蜂幼虫化蛹率和羽化率的影响Fig.4 Effects of vitamin C on pupation rate and eclosion rate of larvae for Apis cerana cerana

2.1.3 维生素 C对不同阶段中华蜜蜂幼虫Cu/Zn-SOD基因相对表达量的影响

由图5可知，中华蜜蜂幼虫不同发育时期Cu/Zn-SOD基因的相对表达量均随着饲粮中维生素C含量的增加先升高后降低。其中，各试验组6日龄幼虫和3日龄蛹Cu/Zn-SOD基因的相对表达量均显著高于对照组(P＜0.05)，且以Ⅲ组的相对表达量最高。对于刚出房的1日龄成蜂的Cu/Zn-SOD基因的相对表达量，各组之间差异均不显著(P＞0.05)。

2.2 维生素C对中华蜜蜂工蜂生存能力的影响

2.2.1 维生素C对工蜂平均寿命的影响

由表3可知，工蜂的平均寿命随着饲粮中维生素C含量的增加先增加后减少，具体表现为各试验组均显著高于对照组(P＜0.05)，其中Ⅷ组的平均寿命最长，为24.204 d。分析工蜂的存活曲线(图6)发现，添加维生素C的各试验组工蜂的生存时间明显长于对照组，而且Ⅷ组工蜂的存活率高于其他试验组，存活的时间最长。

图5 维生素C对不同阶段中华蜜蜂幼虫Cu/Zn-SOD基因相对表达量的影响Fig.5 Effects of vitamin C on the relative expression level of Cu/Zn-SOD gene of larvae for Apis cerana cerana in different stages

表3 维生素C对工蜂平均寿命的影响Table 3 Effects of vitamin C on average lifespan of worker bees d

2.2.2 维生素 C对不同阶段工蜂 Cu/Zn-SOD基因相对表达量的影响

由图7可知，各日龄工蜂Cu/Zn-SOD基因的相对表达量均随着饲粮维生素C含量的增加而减少，其中Ⅸ组3、9、15日龄工蜂以及Ⅷ组 9、15日龄工蜂Cu/Zn-SOD基因的相对表达量均显著低于对照组(P＜0.05)。

图6 维生素C对工蜂存活率的影响Fig.6 Effects of vitamin C on survival rate of worker bees

图7 维生素C对不同阶段工蜂Cu/Zn-SOD基因相对表达量的影响Fig.7 Effects of vitamin C on the relative expression level of Cu/Zn-SOD gene of worker bees in different stages

3 讨论

蜜蜂营养对蜜蜂正常生长与繁衍的重要作用，一直受到世界各国蜜蜂科研工作者的广泛关注，特别是蜜蜂对维生素的需求，现已成为人们关注的焦点之一。维生素C作为具有抗氧化活性的水溶性维生素，对大部分植食性昆虫是必不可少的，这也是这类昆虫的特点［13］。在生物体的有氧代谢过程中，维生素C能够保护机体免于氧化剂的威胁，在机体的抗氧化过程中发挥着重要的作用［3］。本试验在饲粮中人工添加不同浓度的维生素C，分别饲喂中华蜜蜂幼虫和刚出房的工蜂后发现:添加适量维生素C可以提高幼虫的体重、抗氧化能力和工蜂的生存能力，适量的维生素C能够增加工蜂的寿命，饲粮中维生素C的含量过量反而降低工蜂的寿命，甚至有害健康。这与前人研究的结果［6，11］相符。这表明维生素C不仅是成年工蜂所必需的营养成分，同时也是幼虫发育过程中必不可少的功能性营养物质，对幼虫正常的生长发育起着重要的作用。试验结果还发现，向幼虫基础饲粮中添加10和20 mg/kg维生素C的试验组在6日龄幼虫、3日龄蛹、刚羽化蜜蜂的体重以及化蛹率、羽化率方面均显著高于对照组，表明蜜蜂幼虫饲粮中维生素C的适宜含量为11.6～21.6 mg/kg。另外，饲喂中等浓度(500 mg/kg)维生素C后工蜂的平均寿命最长。然而，蜜蜂是典型的社会性昆虫，以群体为单位，在对蜂群进行人工饲养时，不可能对幼虫和工蜂进行单独饲养。对蜂群饲喂不同含量的维生素C饲粮后，其工蜂分泌的蜂王浆和饲喂给幼虫食物中维生素C含量有待于进一步研究，从而最终确定蜂群对维生素C的营养需要量。

SOD是一种主要的抗氧化酶，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应而生成分子氧和过氧化氢，为清除氧自由基的第1道防线［9］。本研究发现，饲喂添加维生素C饲粮后6日龄幼虫和3日龄蛹Cu/Zn-SOD基因的相对表达量均显著高于对照组，说明维生素C可以提高幼虫的抗氧化能力。然而，在刚出房的工蜂中，Cu/Zn-SOD基因的相对表达量在各试验组与对照组之间均差异不显著，而且对刚出房的工蜂采用不同浓度维生素C饲粮进行饲养后，其Cu/Zn-SOD基因的相对表达量随着维生素C含量的增加而降低，饲喂添加高剂量(2 500 mg/kg)维生素C饲粮的工蜂Cu/Zn-SOD基因的相对表达量在3、9、15日龄均显著低于对照组，可能是工蜂与幼虫的抗氧化性能机制不同，也可能是长时间饲喂维生素C导致的。维生素C本身作为一种抗氧剂，在一定程度上可能替代了Cu/Zn-SOD基因的表达产物发挥抗氧化作用，导致机体抗氧化基因的表达量下降，其具体的作用机理仍需进一步研究。

4 结 论

①中华蜜蜂幼虫人工饲粮中维生素C的适宜含量为 11.6～21.6 mg/kg。

②饲粮中维生素C含量对中华蜜蜂工蜂的生存能力有影响。

致谢:试验中得到了江西农业大学蜜蜂研究所何旭江、王文祥等同学的支持和帮助，在此表示衷心的感谢。

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