博落回生物碱对猪肠上皮细胞增殖的影响

李 杰 伍树松 熊兴耀 苏丁丁* 贺建华*

博落回系罂粟科博落回属，在我国分布广泛、资源丰富。其主要生物活性成分为博落回生物碱，均属异喹啉衍生物类［1］。血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)、原阿片碱(protopine)、别隐品碱(α-allocryptopine)是4种主要的博落回生物碱，在博落回中发挥主要生理功能［2］。国内外研究结果表明，博落回生物碱能显著提高早期断奶仔猪的生长，降低料重比，减少断奶应激反应［3-5］;此外，研究发现饲粮中添加博落回生物碱能显著提高火鸡的生长性能［6］。但在细胞水平研究博落回生物碱对动物生长影响的还很少。为此，本试验旨在通过体外培养猪肠道上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells，IPEC-1)，探讨血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和别隐品碱在不同浓度、不同时间段对IPEC-1增殖的影响，为博落回生物碱对动物生长性能的促进作用以及肠道疾病的预防与治疗提供了新的理论依据和思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

IPEC-1由中国科学院亚热带农业生态研究所动物生态营养健康养殖研究中心惠赠。

1.1.2 主要药品与试剂

血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱由湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心提纯，纯度均大于98%［7］。4-甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)购自Sigma公司。表皮生长因子(EGF)购自Gibco公司。细胞培养基HAM’S/F-12、胎牛血清(FBS)、杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)为Hyclone公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

IPEC-1培养在盛有适量HAM’S/F-12培养基(含5%FBS、1%双抗、0.1%ITS 和 5 μg/L EGF)的培养皿中，置于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2饱和湿度)内培养。

1.2.2 试验分组

试验分为对照组和试验组，对照组用普通培养基培养，试验组在普通培养基中加入不同浓度(高浓度组分别是 4、2、1、0.5、0.25 μg/mL 的血根碱或白屈菜红碱，100、50、25μg/mL的原阿片碱或别隐品碱;低浓度组分别是 0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 μg/mL 的血根碱或白屈菜红碱，25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL 的原阿片碱或别隐品碱。初期浓度划分参照以往研究［8］设定，而后根据博落回生物碱对IPEC-1的抑制及增殖作用区分)的博落回生物碱进行培养，各组不同浓度梯度均设8个重复。博落回生物碱溶于DMSO之后用培养基稀释成所需浓度，DMSO在培养基中的终浓度低于0.1%。

1.2.3 MTT 细胞增殖试验

取对数生长期的IPEC-1用D-PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶消化，加入HAM’S/F-12培养基悬浮细胞，细胞计数板计数，以1×104个细胞每孔接种于96孔板内，前培养24 h，弃去培养基，对照组加入普通培养基100μL，试验组加入含不同浓度博落回生物碱的培养基100μL，每组设8个重复孔;继续培养12或24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10μL，4 h后终止培养，每孔加入0.065 4 mol/L盐酸异丙醇溶液 100μL，吹打后振荡10 min，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定各孔吸光值(OD)。细胞活率计算公式如下:

细胞活率(%)={1-［(对照组OD-试验组 OD)/对照组 OD］}×100。

1.3 统计分析

数据经过Excel进行初步处理后，用SPSS 19数据分析系统(SPSS 19，IBM公司，美国)进行分析，数据表示为平均值±标准差(SD)，所有数据均经过3次以上重复试验。显著性分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，使用邓肯氏法多重比较(Duncan’s Multiple Range test)。P＜0.05 表示为差异显著。

2 结果

2.1 高浓度博落回生物碱对IPEC-1增殖的影响

为探讨4种博落回生物碱对IPEC-1的毒性影响，本试验首先使用了较高浓度的博落回生物碱处理IPEC-1。不同浓度的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱处理IPEC-1 12 h后，通过MTT染色检测细胞存活率。结果如表1、表2所示，高浓度的博落回生物碱能抑制IPEC-1的生长。本研究中，0.25～4 μg/mL 的血根碱、0.25～4 μg/mL的白屈菜红碱、100μg/mL的原阿片碱或100μg/mL的别隐品碱对IPEC-1的增殖有显著的抑制作用(P＜0.05)。随着浓度的降低，这种抑制趋势随之减弱，25～50μg/mL的原阿片碱和别隐品碱对IPEC-1的生长无显著影响(P＞0.05)，且具有一定的上升趋势。

2.2 低浓度博落回生物碱对IPEC-1增殖的影响

为探讨低浓度博落回生物碱对IPEC-1增殖的影响，本试验随后降低了博落回生物碱的处理浓度。结果如表3、表4所示，IPEC-1经低浓度的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱或别隐品碱处理12 h后，细胞数目增加，其中 0.006 25～0.1 μg/mL 的血根碱、0.006 25～0.1 μg/mL 的白屈菜红碱、3.125～ 25 μg/mL 的 原 阿 片 碱 或 1.562 5 ～25μg/mL的别隐品碱对IPEC-1增殖具有显著的促进作用(P＜0.05)。随着博落回生物碱浓度的不断下降，这种促进作用又慢慢减弱，由表3、表4可知，血根碱对IPEC-1增殖的促进作用在0.012 5μg/mL时达到峰值，白屈菜红碱、原阿片碱 和 别 隐 品 碱 则 分 别 为 0.025、6.25 和12.5 μg/mL，1.562 5 μg/mL 的 原 阿 片 碱 处 理IPEC-1 12 h对细胞无显著影响(P＞0.05)。

表2 高浓度原阿片碱和别隐品碱对IPEC-1增殖(细胞活率)的影响Table 2 Effects of high concentrations of protopine and allocryptopine on IPEC-1 proliferation(cell viability) %

表3 低浓度血根碱和白屈菜红碱对IPEC-1增殖(细胞活率)的影响Table 3 Effects of low concentrations of sanguinarine and chelerythrine on IPEC-1 proliferation(cell viability) %

2.3 延长博落回生物碱处理时间对 IPEC-1增殖的影响

为探讨博落回生物碱促进IPEC-1增殖的作用周期，本试验通过延长低浓度博落回生物碱对IPEC-1的作用时间，观察其对IPEC-1的影响。结果如表3、表4所示，IPEC-1细胞经低浓度博落回生物碱处理24 h后，细胞密度与对照组差异减少，仅0.1μg/mL的白屈菜红碱、25μg/mL的原阿片碱和25μg/mL的别隐品碱表现出显著性差异(P＜0.05)，其余各组与对照组相比均无显著性差异(P＞0.05)。

3 讨论

博落回生物碱因其具有抗菌、杀虫、抗肿瘤、改善肝功能、增强免疫力等多方面的药理作用而备受关注［9］，近年来，国内外研究表明博落回生物碱还能有效提高动物的生长性能。研究发现，博落回生物碱具有促生长作用的主要原因可能是通过与肠道接触而发挥抗菌和抗炎作用［10］，从而降低断奶仔猪腹泻率、保障肠道健康。而Lenfeld等［11］研究认为，博落回中含有的四苯并菲陡生物碱具有抑制胆碱脂酶活性、刺激唾液分泌、利尿、外周抗肾上腺素解交感作用［12］和通过抑制芳香族氨基酸脱羧酶来调节色氨酸-5-羟色胺代谢途径，而增加饲养动物的采食量［13］，这2种作用的结合是它提高动物生长性能的原因。

表4 低浓度原阿片碱和别隐品碱对IPEC-1增殖(细胞活率)的影响Table 4 Effects of low concentrations of protopine and allocryptopine on IPEC-1 proliferation(cell viability)

本试验通过体外培养IPEC-1，探讨了博落回生物碱对在猪肠上皮细胞增殖的影响，以期为探讨博落回生物碱对动物生长性能的影响提供新的研究思路。IPEC-1是分离自未吮乳的新生仔猪小肠上皮细胞，属于非转化性最初的连续培养小肠细胞系，具有典型的猪小肠上皮细胞特性［14］，而小肠(包括十二指肠、空肠与回肠)是机体营养物质最主要的消化、吸收器官，营养物质被分解后通过小肠吸收进入血液和淋巴液，进而参与机体代谢［15］。有研究表明，肠上皮细胞的增殖与肠黏膜重量和绒毛高度的改变有着紧密的联系，而小肠绒毛高度的增加是小肠吸收功能增强的重要标志［16］。因此，肠上皮细胞的增殖可以增强小肠的消化、吸收、免疫屏障等功能，并提高应对应激反应的能力，进而提高动物的生长性能。

研究表明，博落回生物碱能够对细胞线粒体、内质网和核膜等膜性结构造成破坏，从而导致细胞凋亡［17］。本研究中，IPEC-1经高浓度的博落回生物碱处理后，细胞活率显著下降，这在一定程度上印证了博落回生物碱的细胞毒性。然而，当处理浓度降低时，博落回生物碱不仅未体现出对IPEC-1的毒性作用，反而促进了该细胞的增殖，随着浓度的进一步降低，这种促进作用又逐渐减弱。此外，随着作用时间的延长，博落回生物碱对IPEC-1增殖的促进作用也随之减弱。这在一定程度上表明，博落回生物碱对IPEC-1可能具有某种营养作用，能参与细胞的代谢。浓度范围内有显著的增殖作用，说明其提高动物生长性能可能是通过促进小肠细胞增殖分化更新，来增强小肠消化、吸收、免疫屏障和应激反应等作用的途径实现的。

4 结论

①高浓度的博落回生物碱对IPEC-1的增殖有显著的抑制作用，其细胞毒性的浓度分别为血根碱＞0.25 μg/mL，白屈菜红碱＞0.25 μg/mL，原阿片碱＞100μg/mL，别隐品碱＞100μg/mL。

②低浓度的博落回生物碱对IPEC-1的增殖有显著的促进作用，且具有一定的浓度范围。其中血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和别隐品碱浓度分别在 0.012 5、0.025、6.25 和 12.5 μg/mL 时对IPEC-1增殖的促进作用达到峰值。

③博落回生物碱对IPEC-1的增殖具有一定的作用周期。

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