臭氧后处理对大鼠肾脏缺血/再灌注后Smad-7表达的影响

王 磊,刘修恒,陈 晖,陈志远,翁小东,邱 涛,刘 林

(武汉大学人民医院泌尿外科,武汉 430060)

肾脏缺血/再灌注损伤(ischemic and reperfusion injury,IRI)是肾缺血组织在得到血液再灌注后发生的组织细胞损伤加重的一种病理现象，是临床上不可避免的病理过程之一，有学者认为，肾脏IRI对移植肾功能的影响要大于人类白细胞抗原系统配型不合[1]。研究表明，转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smads信号转导通路在肾脏中非常重要，而Smad-7作为该通路中的内源性抑制因子，发挥着重要作用[2]。目前，关于臭氧后处理对大鼠肾脏IRI后Smad-7表达的影响尚无文献报道。本研究欲探讨臭氧后处理对肾脏IRI后Smad-7表达的影响，并进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1模型的建立与分组 选取由武汉大学医学院实验动物中心提供的健康雄性SD大鼠24只，均为8周龄，体质量为220～250 g。采用随机数字表法将大鼠分为3组，每组8只。假手术组：腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)，麻醉大鼠，然后游离双侧肾脏，切除右肾后缝合腹壁。IRI组：在游离双侧肾脏及切除右肾后，用无创伤血管夹夹闭左肾动、静脉45 min制造缺血，然后开放血管夹进行再灌注24 h，余同假手术组。肾脏由暗红色变成鲜红色代表再灌注成功。臭氧后处理(ozone postconditioning，OP)组：再灌注后10 d内，对该组大鼠经直肠吹入氧气和臭氧的混合气体2.5～3.0 mL[臭氧浓度为50 mg/L，0.5 mg/(kg·d)][3]，余同缺血/再灌注组。

1.2仪器与试剂 YKS-1000臭氧发生仪购自珠海依科医疗器械有限公司，Smad-7和β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.3样本采集和处理

1.3.1标本采集 分别于IRI 24 h后采集大鼠腹腔静脉血待测，处死各组大鼠获取肾脏组织，一部分迅速置于液氮中保存，另一部分用固定液固定后，常规石蜡包埋。

1.3.2血清尿素氮和肌酐的检测 将采集的大鼠血液标本常温离心，获取大鼠血清，使用Olympus全自动生化分析仪(Au2700)测定血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,Cr)水平。

1.3.3肾组织病理学检查 取大鼠肾组织，用多聚甲醛固定后脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红染色，之后在400倍光镜下观察其病理改变。

1.3.4蛋白免疫印迹法检测Smad-7 从-80 ℃冰箱中取出保存后的肾组织，采用BCA(bicinchoninic acid)试剂盒检测蛋白浓度，取20 μg蛋白上样，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、转膜，50 g/L脱脂牛奶封闭2 h后加入1∶1000稀释的Smad-7兔抗大鼠多克隆抗体，4 ℃下摇床过夜。之后与辣根过氧化物酶结合的羊抗兔抗体(1∶2000稀释)结合，洗膜后化学发光法显色、照相，并作灰度值分析。

2 结 果

2.1各组大鼠血清Cr和BUN水平的比较 假手术组相比，IRI组的Cr、BUN水平显著增高；而与IRI组相比，OP组BUN和Cr显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.2各组大鼠肾组织学观察结果 光镜下可见假手术组的大鼠肾组织结构改变不明显。而IRI组可见肾小管上皮细胞刷状缘消失，上皮细胞变性、坏死明显，肾小管腔明显扩张，管腔内可见管型。OP组可见上皮细胞扁平，仅部分刷状缘消失，部分管腔明显扩张，偶见管型，与IRI组相比组织病理学改变明显减轻。

表1 各组大鼠血清Cr、BUN水平的比较

图1-1 假手术组 图1-2 缺血/再灌注组 图1-3 臭氧后处理组

2.3各组大鼠肾组织Smad-7表达的比较 根据灰度值分析可知，与假手术组相比，IRI组Smad-7的表达量显著降低；而与IRI组相比，OP组中Smad-7的表达明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2-1 蛋白免疫印迹结果显示Smad-7的表达水平

图2-2 Smad-7与内参的相对比值

3 讨 论

臭氧的医疗用途开始于外科创伤治疗，其机制主要是广谱杀菌、抗炎、促成局部组织再生，随后，臭氧的医疗用途逐步涉及到心血管、内分泌、肿瘤等多个临床科室[4]。在肾移植中，IRI是影响移植肾存活率的重要因素之一，尤其在再灌注后产生大量的活性氧，会导致细胞凋亡，进一步加重损害[5]。目前关于臭氧对IRI保护作用的报道较多，但都集中于预处理，本团队的前期研究也已经证实，臭氧预处理能够保护大鼠肾脏IRI，其机制与减轻脂质过氧化反应、减少炎性因子合成有关[6]。虽然该方法具有保护作用，但在实际临床工作中，由于组织器官发生缺血的不可预见性，使得臭氧预处理的应用受到了很大的限制，而臭氧后处理可以克服这个困难。Smads蛋白是在细胞内参与信号转导的一类蛋白质，在新近的研究中发现其是TGF-β1信号转导通路的下游调节因子，其中Smad-7是该信号通路中最重要的抑制因子[7]，对细胞内环境的稳定有积极作用。有研究发现，TGF-β诱导肾小管上皮细胞的生长停滞、凋亡以及间质纤维化，与其细胞内Smad-7负调控作用的不足有关[8]。但也有研究表明该负调控作用有缺点，当缺乏配体时，Smad-7主要位于核内，而有配体存在时，Smad-7需转移至细胞质中才能与受体结合发挥作用，但该调控机制反应较慢，因此有学者建议将外源性Smad-7基因转到培养的肾小管细胞中，来拮抗TGF-B1诱导的G1停滞，减低细胞凋亡。目前对于Smad-7在大鼠肾脏IRI后的表达情况少有报道。本研究欲观察臭氧后处理对大鼠肾脏IRI损伤后Smad-7表达情况的影响，并对其保护机制作进一步探讨。

肾脏IRI损伤的机制至今尚未完全阐明，主要学说包括氧自由基作用、白细胞作用、钙超载、活性因子作用等方面。据文献报道，移植肾脏缺血/再灌注后引起的肾细胞凋亡是IRI的重要原因[9]，在本实验中，与假手术组相比，IRI组和OP组的Cr、BUN水平均显著升高，而OP组能够明显减轻因IRI导致的Cr、BUN的上升，差异有统计学意义，说明臭氧后处理可以改善肾功能。组织病理学检查结果也提示，假手术组无明显改变；IRI组可见肾小管上皮细胞刷状缘消失，上皮细胞变性、坏死明显，肾小管腔明显扩张，管腔内可见管型。而OP组与IRI组相比组织病理学改变明显减轻，可见上皮细胞扁平，仅部分刷状缘消失，部分管腔明显扩张，偶见管型。蛋白免疫印迹实验结果显示，假手术组相比，IRI组的Smad-7的表达量明显降低；而OP组可以明显上调Smad-7的表达量，差异有统计学意义。

本研究结果证明了臭氧后处理能明显提高肾脏缺血/再灌注组织中Smad-7的表达，来发挥肾脏保护作用，但是对于臭氧后处理通过什么途径上调Smad-7的表达、是否与TGF-β1有关，需要在今后的研究中进一步证实。

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[8] Dzieran J,Fabian J,Feng T,etal.Comparative analysis of TGF-beta/Smad signaling dependent cytostasis in human hepatocellular carcinoma cell lines[J].PLoS One,2013,8(8):e72252.

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