沙门氏菌快速检测显色培养基的研制

李 超，陈晓珑，李 莹，张晓峰，李文杰

（郑州大学 公共卫生学院，河南 郑州 450001）

0 引言

沙门氏菌（Salmonella）是主要的食源性致病菌之一，其引起的食物中毒病例位居首位[1].目前的检测方法由传统检测法发展到免疫组学、分子生物学和电化学等方法[2]，但因上述方法操作繁琐且检验成本高，难于推广来满足食品生产销售过程中沙门氏菌的快速检测，因此快速显色培养基检测成为近年来的研究热点.其原理是利用微生物特异性酶的特点，通过对应的酶显色底物对目标微生物进行筛选鉴定[3].酶显色底物是由特异性酶识别基团以及相应的显色基团两部分组成，显色基团的主要成分是苯酚衍生物[4].本研究选择5溴-6 氯-3 吲哚-β-D 半乳糖苷（M-gal）作为沙门氏菌的显色底物[5]，以普通营养培养基为底板，通过正交优化试验，确定沙门氏菌快速检测显色培养基（Rapid detection of Salmonella Chromogenic Medium，RSCM）配方.对照沙门氏菌国标检测法，分析RSCM 的出菌率、特异性和检出时间，综合评价RSCM 的检测性能，以期研制出一种应用于生产与销售等日常检测环节，易操作，检测结果迅速、准确，同时还具有较好的普及推广性的沙门氏菌快速检测培养基，为快速检测食品中沙门氏菌提供一定的科学理论基础.

1 材料和方法

1.1 菌株

以伤寒沙门氏菌（CMCC（B）50071）为试验菌株；以鲍氏志贺菌（CMCC（B）51336）、志贺菌I 型（CMCC（B）51105）、志贺菌II 型（CMCC（B）51582）、宋内志贺菌（CMCC（B）51592）、福氏志贺菌（CMCC（B）51573）、大肠杆菌（CMCC（B）44103）和大肠杆菌（ATCC25922）为对照菌株.以上菌株均由郑州大学基础医学院鉴定保存.

1.2 主要试剂和仪器

蛋白胨粉、酵母膏粉和L-胱氨酸：国药集团化学试剂有限公司；月桂基硫酸钠、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷：美国Genview 公司；亚硫酸铋（BS）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）和亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：广东环凯微生物科技有限公司；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和无水碳酸钠：天津市凯通化工技术有限公司.

HVE-50 高压灭菌锅：日本HIRAYAMA 公司；AL204 电子分析天平：梅特勒托利仪器上海有限公司；GNP-9080 隔水式恒温培养箱和S-25 精密pH计：上海精宏实验设备有限公司；SW-CJ 超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司.

1.3 RSCM 的制备

1.3.1 RSCM 基础培养基配方的正交优化

RSCM 基础培养基配方包括蛋白胨、酵母膏粉、氯化钠、月桂基硫酸钠、碳酸钠和L-胱氨酸[6].参照单因素试验结果，以其用量为因素，加入误差项后应用MINITAB15.1 进行7 因素3 水平正交试验[7]，平行测定3 次，因素及水平见表1.

表1 因素与水平 g·L-1

1.3.2 RSCM 显色底物的剂量确定

以表1 筛选出的配方为基础，分别添加不同浓度的显色底物M-gal 并以伤寒沙门氏菌为对象进行单因素分析确定最佳剂量.

1.3.3 RSCM 的制备

使用分析天平准确称取各配方，加入去离子水，加热煮沸至溶解，冷却至60 ℃左右时注入无菌塑料平板内，彻底冷却凝固后形成RSCM.

1.4 RSCM 出菌率的测定

将活化后的伤寒沙门氏菌用无菌生理盐水进行10 倍梯度稀释，吸取各梯度菌液0.l mL 分别涂布于营养琼脂、RSCM 和国标BS、XLD 培养基平板上，每个平板重复3 次.于（36±1）℃分离培养18～24 h 后进行菌落计数并分别计算上述3 个培养基的出菌率[8]，使用F 检验对出菌率结果进行分析.

1.5 RSCM 特异性的测定

用营养肉汤分别将伤寒沙门氏菌和7 种对照菌株于37 ℃培养24 h，然后分别接种在RSCM上，于（36±1）℃培养12～24 h 后观察各菌株在RSCM 上的生长状况.同时，以国标方法做特异性检验，以参照比对.

1.6 RSCM 检出时间的测定

分别将伤寒沙门氏菌和由试验菌株和7 种对照菌株形成的混合菌株涂布于RSCM、XLD 和BS培养基平板上，分别于6、12、18、24 和48 h 对3 个平板上的沙门氏菌进行菌落计数，确定检出时间.

1.7 数据处理

采用MINITAB15.1 对正交试验进行设计与分析，采用SPSS12.0 对试验结果进行统计学分析，统计量采用F 检验，检验水准为α=0.05.

2 结果与分析

2.1 RSCM 基础培养基试验

2.1.1 RSCM 基础培养基成分正交试验

基础培养基中各因素对菌落数的影响见表2.由表2 可知，6 种成分对菌落数的影响顺序为：月桂基硫酸钠＞酵母膏粉＞蛋白胨＞碳酸钠＞L-胱氨酸＞氯化钠.最优方案为D2B2A2E2F3C2，即月桂基硫酸钠0.2 g/L，酵母膏粉3 g/L，蛋白胨25 g/L，碳酸钠0.02 g/L，L-胱氨酸0.04 g/L，氯化钠5 g/L.

表2 基础培养基中各因素对菌落数的影响

2.1.2 RSCM 显色底物剂量的确定（表3）

由表3 可见，M-gal 各浓度间的菌落计数差异无统计学意义（F=0.169，P＞0.05）.但M-gal 浓度的改变对沙门氏菌的显色状况影响较大，并且随着时间的延长，显色效果稳定.当M-gal 浓度不低于0.60 g/L 时，RSCM 的显色效果较佳.从经济成本方面考虑，将RSCM 中的显色底物最终浓度设定为0.60 g/L.

表3 M-gal 浓度对菌落数的影响（lgCFU） （±s）

表3 M-gal 浓度对菌落数的影响（lgCFU） （±s）

注：各组间菌落计数对比，P>0.05，差异无统计学意义.

2.2 RSCM 的出菌率（表4）

由表4 可见，沙门氏菌在RSCM 以及国标方法中的XLD 和BS 培养基平板中的出菌率分别为90.7%、89.1%和87.6%.经F 检验，沙门氏菌在以上3 个平板上的菌落数差异无统计学意义（F=0.757，P＞0.05）.

表4 沙门氏菌在不同培养基上的出菌率

2.3 RSCM 的特异性（表5）

由表5 可看出，对照菌株在RSCM 上不显色或无菌落出现，伤寒沙门氏菌在RSCM 和XLD、BS 培养基平板中的结果完全一致.

表5 RSCM 特异性检测结果

2.4 RSCM 的检出时间

分别观察伤寒沙门氏菌和混合菌株在RSCM、XLD 和BS 培养基平板上分别培养6、12、18、24、48 h 的生长状况，结果如表6 所示.RSCM 在12 h检测出的菌落数与XLD 培养基平板24 h 检测出的菌落数和BS 培养基平板48 h 检测出的菌落数差异无统计学意义（F=2.707，P＞0.05；F=0.981，P＞0.05）.

表6 RSCM 与国标法培养基平板不同时间对沙门氏菌的检测结果 （±s）

表6 RSCM 与国标法培养基平板不同时间对沙门氏菌的检测结果 （±s）

3 结论

利用营养琼脂培养基作为底板，添加6 种基础配方，并采用一种全新的酶显色底物M-gal，制备了RSCM 来检测沙门氏菌.该方法沿用显色培养基的原理，制作过程简单、操作简便.其中，Mgal 对于沙门氏菌的生长无任何作用，但其浓度对显色效果有很大影响.由于添加了M-gal，RSCM可根据菌落颜色鉴别沙门氏菌，结果易于观察，在（36±1）℃培养12 h 即可显色，且效果稳定.此外，通过对比RSCM 与国标法的出菌率、特异性和检出时间，发现RSCM 的各成分和浓度完全符合沙门氏菌生长的需要，能够提供充足的养分，并且检测结果可靠.因此，RSCM 在检测沙门氏菌方面具有良好性能，特别在检测时间方面具有很大优势，可满足快速检测的要求，可向卫生检验检疫部门、食品生产厂家以及各大销售厂商进行普及推广.

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