脑缺血/再灌注神经元钙离子通道的研究进展

石咏梅(综述)，葛金文(审校)

(1.湖南中医药大学中医学院解剖教研室，长沙 410208； 2.湖南中医药大学中西结合学院，长沙 410208)

脑缺血一定时间后恢复血液供应，其功能不但不能恢复，而且出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)[1]。目前研究认为，CIRI的发生机制主要与自由基过度形成、细胞内Ca2+超载及细胞凋亡等密切相关，其中Ca2+超载可触发一系列下游反应,包括胱天蛋白酶的激活、ATP合成障碍、钙依赖性蛋白酶和核酸酸内切酶的激活等,而这些事件最终导致CIRI时神经元的损伤和死亡[2]。然而，不同种类的细胞和不同生物膜上存在的钙离子通道不尽相同。例如，钙池操纵的Ca2+通道是存在于包括肝细胞在内的非兴奋细胞钙内流的主要通道[3]。因此，该文拟通过探讨在CIRI发生时神经元上钙离子通道的变化揭示CIRI的机制，进而为CIRI的预防提供理论指导。

1 神经元胞膜钙离子通道

1.1钙离子通道的类型及相关作用 在神经元细胞膜上有两类钙离子通道-电压依赖性通道(voltage-depent calcium channel，Cav)和配体操控性通道。Cav是由多亚基构成的跨膜蛋白复合体，分布在细胞膜上控制Ca2+进入胞内，它们是由α1、α2/δ、β亚单位和钙调蛋白(calmodulin,CaM)构成的复合体[4-5]。其中α1亚单位是构成通道的主要亚单位，包含离子选择通道、电压感受器、门控装置以及第二信使、药物和毒物等通道调节物质的结合位点[6-7]。α1亚单位包含四个同源跨膜片段，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ，β亚单位即是通过α1亚单位的Ⅰ～Ⅱ片段与之相结合。这四个同源跨膜片段是1600～2400个氨基酸组成的多肽链，它们形成一个四聚体结构，中间是钙离子的通道[8]。α1亚基每一个跨膜片段含6个α螺旋环(S1～S6)，在6个α螺旋环(S1～S6)中，S4是电压门控钙离子通道α1亚基的重要组成部分，S5和S6之间存在一个不对称的环状氨基酸序列被称为P环,P环与S5和S6一同构成了钙离子通道的选择性滤孔，为通道特异性的位点[9]。S6与连接S1和S2的结构域以及钙离子通道细胞膜内的C端一起构成了钙离子通道调节物质作用的特异位点,钙拮抗剂即可与此位点结合,同时该位点也是电压依赖性失活的结构基础(图1：Cav结构示意图)[10]。

图1 Cav结构示意图 1-1：是CaV1或CaV2通道的结构图，图中显示Cavα1有四个同源跨膜片段组成。Cavβ以高亲和力结合在α1亚基的Ⅰ～Ⅱ胞内环(被称为α-结合区段即AID)上。CaM在α1亚基的IQ区段与其胞质内的C末端结合。Cavα2δ也与α1亚基结合 1-2：是Cav局部结构图，图中显示了CaV1.2 CaVβ/AID复合体以及Ca2+/CaM-PreIQ和Ca2+/CaM-IQ复合体的形成部位

Cav对有机钙阻滞剂敏感，最近Jakubek等[11]发现用于神经组织再生工程的碳微管中的可溶性成分钇也可剂量依赖性地抑制神经元上的电压依赖性的钙通道。根据钙离子通道的结构功能特点和对阻断剂的敏感性不同，钙离子通道分为L型、N型、P/Q型、R型和T型5种类型。其L型、N型、P/Q型、R型为高压激活钙离子通道，可被较强的除极激活(+30～+50 mV)。T型钙离子通道为低压激活钙离子通道，其活化所需要的膜电位是-55～-20 mV。通过对血管平滑肌的电压门控钙通道的研究发现，L型钙通道具有强除极激活、大电导以及失活缓慢、开放时间较长等特点[12]。

有研究表明，不同类型的Cavα1亚基的基因编码不同，目前人们发现至少10种编码α1亚基的基因。其中Cav1基因编码的α1亚单位所构成的是L型钙离子通道，而Cav2.1基因编码的是P型和Q型通道，Cav2.2基因编码的是N型钙离子通道，Cav3基因编码的是T型钙离子通道,该通道能够被二价镍离子阻断[13]。在脑区的电压依赖性通道以L、N、P为主。P/Q型钙离子通道和N型钙离子通道主要分布于神经-肌肉的突触前末端，其开放能够使钙离子流入神经节致使神经递质的释放[14]。

配体操控性钙离子通道包括谷氨酸依赖性通道即N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体通道和非谷氨酸依赖性通道两大类。NMDA受体是受配基调节的离子通道，对Ca2+具有通透性，介导Ca2+内流，可被Mg2+电压依赖性阻断。而非谷氨酸依赖性通道是近年来研究的热点,研究表明它们是一些参与控制Ca2+内流或外排，负责维持Ca2+动态平衡的整合膜蛋白，其中包括细胞外酸化时激活的酸感受性离子通道(acid sensing ion channels,ASICs),缺氧缺糖时激活的瞬时受体电位通道(transient receptor potential protein2,TRPM2)、TRPM7以及依赖细胞膜两侧电化学梯度的Na+-Ca2+交换体(Na+-Ca2+Exchanger，NCX)等[15]。激活的瞬时受体电位通道TRPM2和TRPM7以及ASICs均能介导Ca2+内流，而激活的钙泵(Ca2+，Mg2+ATP酶)和NCX则促进Ca2+排出细胞外。最近的研究表明,激活的瞬时受体电位通道产生的瞬时型感受器电位在生长锥延伸和转向上有重要作用[16]。

1.2CIRI发生时神经元胞外钙离子通道的改变 在早期的研究中，唐瑜[17]使用膜片钳技术发现，L型钙通道在脑缺血/再灌注损伤的过程中表现出异常的开放活动，在观察的6个时间点(0、0.5、1、6、12、24)中，再灌注24 h时L型钙通道开放概率最高，且显著高于正常组；而0、6、12、24 h通道平均开放时间显著高于正常组；0.5 h通道电流幅度明显高于正常组，差异有统计学意义。提示在CIRI后，神经元出现的钙超载可能与L型钙通道开放时间延长、开放概率增加和通道电流幅度的增大有关。

随后的研究发现，脑缺血时兴奋性氨基酸尤其是谷氨酸的浓度显著升高，从而过度激活NMDA受体,使该受体调控的钙离子通道开放，引起大量的Ca2+内流，从而对缺血的神经元产生毒性作用，有研究表明蛋白激酶CβⅡ亚单位参与了激活NMDA受体引起的钙胞内钙超载[18]。

然而在临床试验中发现，使用NMDA受体拮抗剂并不能完全阻断钙离子内流引起的钙超载，提示还有其他的非谷氨酸依赖的Ca2+通道存在。TRPM2、TRPM7以及ASICs和NCX是近年来发现的在缺血/缺氧及再灌注损害时能够引起钙超载的新角色。

CIRI引起神经元缺血缺氧,从而导致ATP产生降低，钙泵失活，Na+，K+ATP酶功能衰竭，神经元胞内Na+浓度迅速升高，神经元胞膜除极，电压依赖性钙通道开放，引起大量的Ca2+内流；同时神经元胞外Ca2+浓度迅速降低，神经递质谷氨酸从突触部位释放到突触间隙，激活NMDA受体，Ca2+内流增强；胞外Ca2+浓度降低诱发更多的Ca2+通过TRPM7和TRPM2通道进入细胞；同时无氧代谢产生的乳酸堆积诱发ASICs通道的开放，加剧钙内流。而同时被激活的NCX则促进Ca2+排出细胞外，但其作用不足以代偿维持Ca2+胞内外的平衡，导致胞内严重的钙超载。

2 神经元胞内的钙离子通道

2.1钙离子通道的类型及相关作用 神经元胞内的钙离子通道即内钙释放的通道，存在于内质网膜和线粒体膜(合称为肌质网膜)上，属于受体操控性钙离子通道，包括三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5trisphosphate receptor,IP3R)钙离子通道和ryanodine敏感的钙离子通道。两者的结构和功能有很多共同之处，例如胞内钙浓度从nmol/L到μmol/L的变化就可以同时被两种受体感知,导致两者被激活，相反的浓度变化则可以使它们失活；他们在调节上也都是双重的。ryanodine敏感的钙离子通道可被环磷酸腺苷核糖磷酸化激活，被蛋白激酶C磷酸化而失活，IP3R可同时被G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体激活。调节IP3R的信号通路是胞外信号-磷脂酶C(phospholipase C,PLC)-磷酸(phosphate，P)-IP3-IP3R。ryanodine敏感的钙通道(RyR通道)分为RyR1、RyR2和RyR3 3个亚型，研究发现脑内存在的主要是RyR3[19]。激活的IP3R通道和RyR通道可将Ca2+从肌质网释放至胞质内，而与此同时肌质网钙ATP酶可逆浓度梯度将Ca2+从胞质泵回到肌质网内，降低胞质Ca2+浓度。

细胞内配体操控性钙通道大多数是由若干胞内信使物质共同调控的,例如通过研究发现B细胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)可以抑制Ca2+通过IP3R通道从内质网的释放(这种作用可能是因为Bcl-2和IP3R之间存在相互作用并形成IP3R/Bcl-2复合体从而抑制了IP3通道的开放，进而抑制细胞因钙超载引起的凋亡)[20],而同时也有实验表明Bcl-2还可以降低内质网腔内CaM和肌质网钙ATP酶的表达,从而降低内质网内Ca2+浓度[21]。

这些细胞内配体操控性钙通道巨大的胞质结构域为多种胞内信号调控其行为提供了作用位点。这些信号包括直接结合受体的蛋白(如CaM、FK-506结合蛋白、钙结合蛋白、凋亡相关因子等),磷酸化受体的蛋白激酶以及诸多小分子第二信使[22-24]。

2.2CIRI发生时神经元肌质网钙离子通道的改变 正常情况下，由于钙泵和NCX等的作用，胞内钙浓度相对稳定，达不到PLC的浓度，不能水解二磷酸肌醇产生IP3。当CIRI发生时缺血缺氧导致胞外钙离子通道异常开放，胞质内Ca2+浓度迅速升高，激活PLC水解二磷酸肌醇产生IP3，使得IP3R通道开放，大量Ca2+从肌质网释放至胞质内，引起钙超载。

细胞内和细胞外钙通道为不同来源的钙提供了通路,同时它们之间也存在重要的相互作用。细胞外进入细胞内的Ca2+能够通过激活Ryanodine受体,诱导钙从细胞内钙池释放。而有研究发现Ryanodine受体介导的细胞内钙池肌浆网钙释放是由L-型电压门控钙通道通过与Ryanodine受体变构偶联激发的[25]。

细胞内钙通道受到众多胞内外信使物质调控，同时一种物质可调控多种钙通道，如CaM不仅可与电压依赖性钙通道α1亚基的异亮氨酸-谷氨酸组成的结构域结合[26]，调节电压依赖性钙通道的开放，而且Kahl等[27]报道CaM参与了Ca2+对肌浆网上的IP3R的抑制。

3 结 语

脑组织主要靠葡萄糖有氧氧化供能，故对缺氧十分敏感，脑卒中、脑创伤、颈动脉内膜切除术等均可引起CIRI。但是其机制还不明确，大多数学者认为是由多因素参与的复杂的病理生理过程。其中钙超载被认为是启动CIRI时神经元损伤的最后共同通路。而导致神经元钙超载的钙离子通道在神经元的不同部位表达不同，同时不同的钙通道之间还存在相互作用。与此同时各个钙离子通道受到胞内外各种调节信号的作用，这些构成了钙离子通路复杂的网络系统。因此，要剖析CIRI时神经元钙离子通道通透性改变的机制，还需要更深入的实验研究。

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