脐带血间充质干细胞向神经细胞诱导分化及应用*

杨军政 综述，李永海，李 萌，林俊堂 审校

(新乡医学院生命科学技术学院干细胞与生物治疗技术研究中心，河南新乡 453003)

自2000年Erices等[1]报道脐带血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞以来，因脐带血间充质干细胞的多向分化潜能，免疫调节作用和无伦理问题等优点，备受研究者的关注。随后，有学者分别报道了脐带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物和神经胶质细胞标志物[2-3]。目前人们已经可以成功地体外分离培养脐带血间充质干细胞，并且对其生物学特性、表面标志和免疫原性有了进一步的了解。近年来成功地诱导脐带血间充质干细胞分化为骨、脂肪、软骨、肝脏及神经等成体细胞，展示了脐带血间充质干细胞的无限分化潜能和广阔的应用前景。从而为体外诱导脐带血间充质干细胞分化各种成体细胞和各种疾病的治疗提供了新的思路。

1 脐带血间充质干细胞的特性及诱导分化

1.1脐带血间充质干细胞的分离与培养 脐带血间充质干细胞的分离主要有以下几种方法[4]：密度梯度离心法、贴壁细胞分离法、流式细胞分离法和免疫磁珠法等。目前采用最多的是密度梯度离心法，但分离的纯度不高。流式细胞分离法和免疫磁珠法都是通过脐带血间充质干细胞表面的特殊标志对细胞进行筛选，分离的细胞纯度较高，但成本较高。

目前在脐带间充质干细胞培养方面没有统一的标准。常用的培养基有DMEM/F12、DMEM、IMEM和MesencultTM等，在培养基中添加胎牛血清或者生长因子的含量和种类也不尽一致，传代培养的方案也不完全相同。由于胎牛血清的成分的复杂性和对结果的不可预知性，目前在干细胞培养过程中，大多采用低血清甚至是无血清的培养基来进行培养，无血清培养方法的进一步成熟有望统一干细胞的培养方法，也为干细胞的基础及临床应用研究奠定了基础。

1.2脐带血间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化 脐带血间充质干细胞是一种多潜能干细胞，具有很强的生命力，并且在体外一定的诱导条件下可以分化为各种神经样细胞。近年来利用脐带血间充质干细胞诱导为神经样细胞实验研究比较多。目前常用的诱导物和诱导方法包括以下几种:(1)生长因子类，包括bFGF、EGF、BNGF和RA等；(2)抗氧化剂类，包括DMSO、β-巯基乙醇、黄芪苷、丹参提取物、枸杞多糖等；(3)基因转染，通过一些基因诸如Noggin、Notch等在脐带血间充质干细胞中表达来获得神经样细胞；(4)细胞共培养，即采用与神经细胞、神经胶质细胞或者其他类神经细胞共培养的方法，通过细胞之间分泌的有关生长或者营养因子、细胞信号等来诱导脐带血间充质干细胞分化为神经样细胞。

有学者分别报道了脐带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物和神经胶质细胞标志物以来[2-3]，许多学者采用不同的诱导方法都成功地诱导获得了神经样细胞。如Arien-Zakay等[5]采用IFN-gamma诱导脐带血间充质干细胞后，发现IFN-gamma可以提高脐带血间充质干细胞向神经细胞的分化，并且可以增强β-tubulin、MAP-2、NF-M、NSE等神经标志物表达。而Li等[6]采用10 μmol/L全反式维甲酸诱导脐带血间充质干细胞12 d后发现，细胞呈现出神经细胞形态，并且表达TH和DAT多巴胺神经标志物。Slovinska等[7]采用磁珠细胞分选法获得CD133+和CD133-两种细胞，采用EGF和bFGF诱导后发现两者都可以诱导表达神经元标志物，并且CD133+细胞表达MAP2、RIP和S100的阳性率要比CD133-细胞高。

而Yang等[8]采用细胞共培养的方法，通过羊膜上皮细胞分泌的多效生长因子刺激脐带血间充质干细胞向神经细胞分化，从而获得多巴胺神经元。Devarajan等[9]采用腺病毒作为载体通过表达Atoh1首次诱导脐带血间充质干细胞为听毛细胞样细胞。随后，管让宪等[10]证明了中药黄芩苷体外诱导人脐带血间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性。黄仕雄等[11]则采用体外转染的方法，用Nurr1基因修饰人脐带血间充质干细胞，成功分化为多巴胺神经元。最近，Divya等[12]采用免疫荧光、荧光激活细胞筛选和PCR的方法研究发现脐带间充质干细胞存在两种细胞群体，两者都表达CD29和CD105，一种细胞群体具有与生俱来的神经形成潜力，同时表达Oct4、Nanog、Sox2、ABCG2等多潜能干细胞标志物和神经外胚层标志物nestin，在简单的刺激下可以像神经细胞分化；而另一种细胞群体则表现为间充质特性，需要多种生长因子刺激下才能分化为神经细胞。

2 脐带血间充质干细胞在治疗神经系统疾病中的研究

脐带血间充质干细胞作为最有潜力的多潜能干细胞之一，其来源丰富、采集方便、安全、无伦理问题，且具有免疫调节作用等特点，决定了其在临床治疗方面具有很大的应用前景。目前干细胞的临床应用有两种方法：一是直接将脐带血间充质干细胞移植体内，通过体内的微环境诱导其为相应的细胞，发挥相应的作用；二是将脐带血间充质干细胞体外培养、定向诱导其分化为目的神经样细胞，然后通过一定的方法植入到体内，治疗相关神经系统疾病。

2.1在脑部损伤中的治疗作用 2001年Chen等[13]在脑卒中行为缺陷的大鼠模型中，静脉注射人脐带血间充质干细胞，发现大鼠的行为缺陷行为有明显的改善。证明脐带血间充质干细胞对脑损伤疾病有一定的治疗作用。随后，Kim等[14]在大鼠幼鼠模型中研究发现，脐带血间充质干细胞在治疗永久性大脑中动脉闭塞引起的重度脑损伤也有很好的治疗作用。2013年，Ahn等[15]将1×105个脐带血间充质干细胞注射到脑出血的SD大鼠的侧脑室部位，发现由脑室内出血引起的出血性脑积水和脑损伤得到很好的改善。2010年Sun等[16]对184名儿童进行了自体脐带血静脉灌注治疗神经损伤，研究发现，自体脐带血静脉灌注治疗儿童神经损伤是安全可行的(除了有3名儿童存在灌注反应外)，从而为脐带血间充质干细胞治疗神经损伤疾病提供了直接的临床证据。

2.2在神经系统变性疾病中的治疗作用 2001年Ende等[17-18]将人脐带血细胞注射到过表达人阿尔兹海默病淀粉样前体蛋白的小鼠体内和亨廷顿氏舞蹈病的小鼠体内，研究发现这些小鼠的寿命有了明显的延长，病情得到好转。证明了脐带血间充质干细胞在治疗神经变性疾病过程中发挥着重要作用。

2011年，Bigini等[19]研究发现，单边脑室内注射人脐带血单核细胞到家族性肌萎缩脊髓侧索硬化症小鼠模型中可以延长小鼠的寿命；检测发现脐带血间充质单核细胞存在于侧脑室，可以保持4个月之久，同时分泌一些具有抗炎性的可以改善运动神经元变性疾病的细胞因子和趋化因子。同年，Veeravalli等[20]将脐带血间充质干细胞用于颤抖性小鼠模型中发现，脐带血间充质干细胞可以存在并在脑内迁移，髓鞘碱性蛋白表达明显上调，1个月后小鼠颤抖完全消失，很好的证明了脐带血间充质干细胞在治疗髓鞘脱落或髓鞘形成不足等神经性疾病中有很好的作用。最近，Seo等[21]将脐带血间充质干细胞注射到发病之前的NPC小鼠的海马组织，研究发现，死亡的神经细胞数量下降，运动缺陷有所改善。

2.3在脊髓损伤中的治疗作用 Kao等[22]采用关闭压力在55 g的动脉钳压迫小鼠1 min致使小鼠脊髓损伤后，将小鼠分为椎板切除术组、椎板切除术+脊髓损伤+CD34-细胞组、椎板切除术+脊髓损伤+CD34+细胞组和椎板切除术+脊髓损伤+生理盐水四组，CD34细胞核生理盐水通过尾静脉注射。研究发现，来源于人脐带血的CD34+细胞通过刺激产生VEGF和GDNF，对脊髓损伤引起的脊髓梗塞、细胞凋亡和后肢功能异常具有很好的治疗作用。而Cho等[23]首先将脐带血祖细胞诱导分化成神经祖细胞，随后移植到脊髓损伤的SD小鼠中10周后发现，小鼠在行动方面有了明显的改观，肢体感觉诱发性电位得到回升，并且这些移植的细胞在坏死穴周围呈现少突细胞表型，这些结果表明由脐带血衍生的神经祖细胞对神经损伤具有一定的治疗作用。2009年，Dasari等[24]在雄性大鼠脊髓损伤模型中研究发现脐带血间充质干细胞修复脊髓损伤过程中可以抑制神经细胞凋亡。随后，Kaner等[25]在大鼠半切脊髓损伤模型中证明脐带血间充质干细胞在脊髓损伤疾病中的治疗具有很好的效果。

最近，Schira等[26]将一种从人脐带血中分离出来的明确已知的无限制的成体干细胞移植到一只脊索严重损伤的免疫抑制成年大鼠的第8胸椎背部半切损伤部位附近，检测后发现，肝细胞生长因子在体内发生定向移动，并在损伤部位聚集，伤口明显变小，并且有利于轴突再生和显著的功能性运动改善。

3 展 望

脐带血间充质干细胞不仅具有多分化潜能的特性，而且来源丰富、采集方便、安全、无伦理问题，且具有免疫调节作用，使其比胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞具有更好的临床应用前景，有可能成为治疗人类遗传疾病特别是中枢神经系统疾病的种子细胞。但其中还存在着一些问题亟待解决:(1)脐带血间充质干细胞的生物学特性还不甚清楚，至今还没有分离鉴定脐带血间充质干细胞的统一的特异性标志,对脐带血间充质干细胞临床应用标准化造成了很大的障碍。(2)当前培养脐带血间充质干细胞的条件还不甚一致。只有采用一致的和标准的无血清培养才能够为进一步的临床应用奠定基础。(3)在体外诱导脐带血间充质干细胞定向分化方面，技术还不是很成熟。譬如向神经元样细胞方向诱导分化，虽然各种各样的方法都可以成功获得神经样细胞，但各种方法诱导的效率并不高，尚不能有效地获得单一种类的神经元细胞，这给进一步临床应用造成很大的不便。(4)成功诱导脐带血间充质干细胞为神经元样细胞的机制还不很清楚，这方面的研究还处于初级阶段。(5)脐带血间充质干细胞在治疗中枢神经系统疾病方面还处于动物实验阶段，距离临床应用还有一定的距离。

总之，脐带血间充质干细胞作为最有潜力的多潜能干细胞，具有多向分化潜能，在体外能够定向诱导分化为各种神经细胞，为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。

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