hARD1与肿瘤细胞凋亡及增殖的相关性研究进展

李春山 综述，白 松 审校

(昆明医科大学第一附属医院干疗科,昆明 650032)

乙酰化在不同的生物过程中起着重要作用，如DNA修复、蛋白质的稳定性和核转位、蛋白质间的相互作用以及细胞增殖、分化和凋亡等[1]。在人类约84%蛋白质N-末端存在乙酰化修饰，其作用对于蛋白质的稳定性和活性产生重大影响[2]。蛋白质乙酰化由一套范围很广的乙酰基转移酶催化；其中N-α-乙酰基转移酶可将乙酰辅酶A的乙酰基转移到新生多肽N端，从而使新生多肽带负电荷，以影响蛋白质的稳定性及活性。相关研究表明50%的酵母蛋白和30%的哺乳动物蛋白受到N-α-乙酰化[3]。

1 人停滞缺陷蛋白1(human arrest defective 1，hARD1)概述

最初在酵母中研究停滞缺陷蛋白1(arrest defective 1 ARD1)发现其具有催化氨基末端α-乙酰化的作用[4]，作为N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferases，NAT)的1个亚基，与细胞周期的调节密切相关；ARD1发生异常会使NATA功能丧失，从而导致酵母表现出多种异常表型[5]；早期研究表明，ARD1缺陷的菌株N末端为Ser、Ala、Gly、Thr的许多蛋白质乙酰化过程出现异常，因此推测ARD1可能是一种新的乙酰基转移酶[6]。hARD1基因与酵母ARD1基因具有高度同源性，其蛋白与N-乙酰基转移酶(NATH)结合形成具有乙酰基转移酶活性的复合物，同时发挥了蛋白质N端α-乙酰化和ε-乙酰化活性[7]；该基因定位于人染色体的xq28区域，全长5 019 bp，含有7个外显子，编码235个氨基酸，蛋白质相对分子质量预测为26.5×103[8]；在人类某些肿瘤及其他疾病研究中，hARD1作为一个NAT基因，近年来逐渐成为研究的热点，从基因至蛋白水平的研究均有所涉及，但现有实验结果提示，hARD1活性调节的多样性和生物效应的特异性，以及hARD1与人类肿瘤和其他疾病发生、发展过程中的作用机制不明，尚有待深入研究。

2 hARD1与细胞凋亡的关系

细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，其诱因很多，如DNA损伤、生长因子撤除、糖皮质激素作用、FasL以及肿瘤坏死因子(TNF)作用、细胞间接触等。其发生的机制极为复杂，除了涉及诸如凋亡因子、受体、适配蛋白、启动蛋白、效应蛋白、抑制蛋白等多种蛋白的相互作用外，还与线粒体和内质网等有关。hARD1作为乙酰化因子在细胞凋亡过程中可能发挥着重要作用。

hARD1通过与受体相关蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)结合从而调节阿霉素诱导的核因子-κB(NF-κB)活性[9]；而(myeloid cell leukemia-1，MCL1)蛋白作为一种抗凋亡蛋白，其基因水平的转录激活需要NF-κB亚单位RelA/p65的乙酰化调节，Xu等[10]通过微阵列技术分析发现，hARD1对RelA/p65翻译后修饰起乙酰化作用，在人结肠癌和人肺癌组织中MCL1和ARD1在mRNA水平呈正相关。因此，发现hARD1可能通过对RelA/p65乙酰化作用从而调节MCL1基因转录，最终达到抑制细胞凋亡的作用。

在柔红霉素(daunorubicin，DNR)诱导凋亡的caspase途径中发现，hARD1及NATH被裂解，使得NAT活性降低40%～80%[11]。Arnesen等[5]用RNA干扰技术使hARD1表达下调亦能诱发细胞凋亡，同时发现hARD1表达下调后细胞对DNR诱导细胞凋亡变得更加敏感；Caroline等[12]通过沉默hARD1发现caspase-3/7活性受到明显抑制；因此推测hARD1可能通过对caspase活性调节从而抑制细胞凋亡。此外，在细胞凋亡研究中发现，C尾部部分断裂与caspases凋亡途径有关，而在hARD1中存在一个活动自由的C端尾部，但其功能依然未知。

在自由基诱导细胞凋亡通路中黄嘌呤氧化酶(XDH)起介导O2生成超氧阴离子(O2-)的作用，从而诱导细胞发生凋亡[13]。有研究发现通过siRNA沉默大肠癌细胞hARD1后XDH显著下调，从而推测hARD1可能通过XDH的变化调节细胞凋亡。但在这条通路中，沉默hARD1后对细胞凋亡调节作用与其他研究结论相反。原因可能在于细胞凋亡存在着促进凋亡和抑制凋亡的复杂调控机制，单个通路的变化不足以决定细胞是否发生凋亡，因此hARD1可能通过多个细胞凋亡通路综合效应而发挥其调节作用，但具体机制有待进一步深入研究。

相关研究表明沉默细胞hARD1后，能诱导细胞凋亡，如Fisher等[14]用RNA干扰技术抑制Hep-G2细胞株hARD1的表达的实验中也证实hARD1沉默具有诱导凋亡作用，同时发现ARD1沉默导致的基因变化趋势与缺氧条件下基因的变化趋势一致。

综上所述，hARD1在细胞凋亡不同途径中发挥着不同的作用，推测hARD1可能通过多途径综合效应对细胞凋亡调节发挥生物学效应，但其具体的作用机制尚未明确，有待进一步深入研究。

3 hARD1与细胞增殖的关系

hARD1在细胞生长和分化中起重要调节作用，研究表明hARD1可能在肿瘤进展过程中起重要作用[15]。因此，目前在研究肿瘤的发生、发展过程中，hARD1逐渐被认为是一种参与癌症进展的重要分子，但hARD1相关酶的调节及生物活性所知甚少。

在肿瘤发生过程中β-链蛋白(β-catenin)信号通路与活化蛋白-1(activator protein1，AP-1)组件协同作用机制能促进癌症的发展[16]，Seo等[17]研究发现，hARD1自体乙酰化是通过转录因子β-catenin和AP-1激活调节细胞周期蛋白(cyclinD1)的表达，从而促进肿瘤细胞增殖的效应；并采用液相色谱-串联质谱法和定点突变分析，确定了其自体乙酰化的靶点K136残基；在体内，抑制hARD1自体乙酰化能显著抑制肿瘤细胞生长，因此推测对hARD1乙酰化状态的调控可能将有利于癌症的治疗。

组织缺氧(hypoxia)与细胞代谢紧密相关，组织缺氧可激活缺氧诱导因子1(HIF-1)转录复合物，该复合物在缺氧条件下对促进肿瘤的存活有重要调节作用[18]。Fisher等[14]研究表明，hARD1可通过对HIF-1乙酰化参与细胞增殖和细胞代谢的调节；通过RNA干扰沉默hARD1后促红细胞生成素和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白水平降低，因此可以推断hARD1促进细胞增殖可能与其对促红细胞生成素和血管内皮生长因子的调节有关。hARD1过表达细胞基因表达谱分析发现hARD1具有潜在调节细胞增殖的功能。葡萄糖吸收和利用是缺氧反应的一个标志，RNA干扰hARD1和低氧条件均刺激葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)表达。因此，可以推测低氧环境下hARD1的生物学效应对于肿瘤的发生起促进作用。

相关研究表明，沉默细胞hARD1后，细胞增殖明显减少。如Lim等[19]在肺癌细胞系用RNA干扰技术沉默hARD1后，发现细胞增殖被抑制，停留在G1期；hARD1敲除后，cyclinD1基因的启动子被抑制，同时与cyclinD1相关的β-catenin/TCF4转录活性被抑制；Fisher等[14]用RNA干扰技术抑制Hep-G2细胞株ARD1表达结果显示细胞增殖也降低；在hARD1移植瘤水平的研究中，Xu等[10]在敲除ARD1后使裸鼠移植瘤生长受到抑制。

综上所述，hARD1在促进细胞增殖的过程中通过不同的途径发挥着生物学功能，如自体乙酰化作用、与相关肿瘤因子的相互作用、低氧诱导因子乙酰化、VEGF、促红细胞生成素等；但对于hARD1在肿瘤发生、发展过程中是所扮演的角色尚未明确。

4 hARD1在肿瘤研究中的作用

肿瘤的发生是一个多步骤、多阶段的形成过程,最终使癌细胞获得了一些重要的特征,包括维持细胞增殖的信号转导、逃逸抑癌基因的抑制作用、抵抗细胞死亡或凋亡的能力、获得永生化复制、诱导新血管生成、激活浸润和转移、能量代谢的再造程序以及避免免疫系统的破坏等[20]。hARD1蛋白在某些肿瘤中的高表达水平与患者的低存活率和肿瘤的侵袭性有关[21]；近年来已发现hARD1和人类肿瘤及相关疾病之间有很多的联系，如乳腺癌、甲状腺癌、大肠癌、肝癌、前列腺癌等。

Yu等[22]对比多种癌组织hARD1的表达，发现在乳腺癌中表达率最高，间接证实hARD1与乳腺癌的关系，并成功制备了运用于人乳腺癌病理检测的抗hARD1单克隆抗体[23]；同时也通过实验表明hARD1的表达与乳腺癌淋巴结转移以及雌激素、孕激素的调节有关[24]；Kuo等[25]的研究发现hARD1在乳腺癌细胞中活性受到抑制，并通过mTOR通路诱导自噬,hARD1高表达对乳腺癌预后有较好的影响。hARD1基因水平的高表达，但其分子水平的抑制现象，可能说明在乳腺癌中hARD1基因组的稳定性缺失，提示对于保持较高水平hARD1的乳腺癌患者预后有益。Zeng等[26]通过对人乳腺癌中hARD1的基因表达谱分析，也发现hARD1高表达对于乳腺癌患者总体预后有益。但能否将hARD1作为乳腺癌预后指标以及治疗的一个靶点仍需深入研究证实。

Arnesen等[27]研究发现在甲状腺癌中，hARD1水平降低而NATH水平增高，这种hARD1与NATH表达分离的情况表明hARD1可能不依赖于NATH而独立发挥作用。Ren等[28]研究发现hARD1在大肠癌组织中高表达，并指出hARD1可能是大肠癌潜在的肿瘤标记物。Arnesen等[29]的研究对比了癌与癌周组织hARD1表达的差异，结果也发现癌组织表达高。白松等[30]通过实验发现hARD1在大肠腺癌中的表达水平不仅与组织类型有关，还与组织分化类型有关。Midorikawa等[31]在用寡核苷酸序列阵比较分析肝细胞癌高分化和中分化组织后，发现hARD1在中分化组明显上调，推测hARD1上调可能与肝癌细胞分化有一定关系。

Wang等[32]研究表明hARD1蛋白在前列腺癌细胞和癌组织中都表达上调；hARD1在雄激素受体(androgen Receptor，AR)表达阳性前列腺癌细胞株中表达较高，在蛋白水平上雄激素-AR信号转导促进hARD1上调，在AR阳性的前列腺癌细胞中，hARD1作为一个癌基因蛋白，促进前列腺癌细胞的生长和增殖以及移植瘤的生长；通过体外和体内实验证明，hARD1通过与AR结合，促进其乙酰化修饰水平，调节靶向基因的转录和报告基因的活性。

在肿瘤的治疗过程中，某些抗癌药物的筛选，主要是通过诱导癌细胞凋亡和/或减少癌细胞的增殖能力，达到延缓癌组织的发生，最终抵抗疾病，治疗患者。在hARD1在肿瘤治疗方面的研究中，Foyn等[33]通过运用酶的特异性底物作为引物合成了具有特殊抑制作用的3种双底物类似物；相信随着对hARD1的深入研究，hARD1蛋白抑制剂的设计和筛选的探索不断会呈现出潜在的应用价值[34]。

5 hARD1面临的问题和展望

hARD1在细胞生长的多个过程中发挥作用，包括细胞凋亡、增殖、分化、代谢等，其作用可能依赖于蛋白质翻译后的乙酰化修饰。hARD1与多种基因之间存在错综复杂的调节关系，与肿瘤的发生、发展可能有关。但是，目前许多问题悬而未决，如hARD1能否独立发挥某些功能？那么需要什么条件、是否和细胞处于极端不利环境有关、单独作为乙酰转移酶的相互作用通路又是什么？是否有某些hARD1的变体能同时发挥N-a-氨基及ε-氨基乙酰化功能？hARD1在肿瘤的发生、发展中到底扮演什么样的角色？在不同组织中，hARD1表达的差异性是否说明它在癌组织中多样性的功能？在肿瘤治疗上，hARD1是否能作为一个潜在药物靶点？此外，hARD1在细胞凋亡、细胞增殖的作用机制亦不十分清楚；这些问题将成为今后研究的重点。

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