固定化失活酵母去除苹果汁中展青霉素工艺的优化

伍小红，袁亚宏，岳田利

(1 西北政法大学 经济管理学院，陕西 西安 710063；2 西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

展青霉素(Patulin)是青霉属、曲霉属、裸囊菌属和丝衣霉属中某些真菌的次生代谢产物[1]，具有致畸、致癌和致突变作用[2]。展青霉素在霉烂的果蔬及其制品中均有发现，且在苹果汁、葡萄汁中表现很稳定[3]。目前，展青霉素的控制方法主要有物理吸附、辐照处理、微波处理、添加食品添加剂处理、生物处理等方法[4-5]。简单的物理吸附法对溶液中的展青霉素具有一定的吸附去除作用，活性炭和膨润土可作为良好的结合剂来吸附溶液中存在的毒素。有研究证明，使用3～5 g/L活性炭对含有展青霉素的苹果汁处理5 min，即可有效降低展青霉素的污染水平[6]；Huebner等[7]开展了基于复合碳-固定床吸附器的苹果汁中展青霉素的控制研究；Kadakal等[8]研究发现，使用活性炭可以将苹果酒中质量浓度为30 μg/mL的展青霉素完全去除。但是上述研究也显示，利用活性碳吸附展青霉素的同时会明显影响果汁本身的品质。在其余控制方法中，辐照处理法局限性较大[9]，微波处理工业化应用难度较大，添加食品添加剂的方法则不适合天然果汁的生产。因此，寻求建立一种高效安全的生物吸附法以实现展青霉素的有效控制是目前国内外研究的热点。

生物吸附是指以酵母、乳酸菌等生物体细胞及其衍生物为吸附剂，实现环境及样品中污染物去除与控制的处理方法[10-11]。酿酒酵母是食品工业中广泛使用的一种微生物，其失活菌体对果汁中的展青霉素具有良好的吸附效果，这一结论在之前的研究中已经得到了充分的验证[12-13]。但是由于失活酵母细胞个体微小，在处理展青霉素之后对其进行分离时存在一定困难，这就限制了失活酵母在果汁生产中的实际应用。而基于材料学与生物学相结合的酵母固定化技术可使失活酵母快速分离与聚集，耐毒害能力增强，特别是使其反应更加稳定，并且减少了微生物的流失，产物更易分离，为基于生物吸附法的展青霉素的有效控制提供了新思路[14-16]。但目前通过固定化技术改良微生物细胞进行污染物去除的研究，主要集中在水体中重金属去除控制方面[17-18]。为此，本试验以固定化失活酵母为吸附剂进行苹果汁中展青霉素的去除研究，通过对去除工艺条件的系统优化，以期为苹果汁中展青霉素的有效控制提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

酿酒酵母，来源于西北农林科技大学食品科学与工程学院发酵动力学实验室；浓缩苹果汁，由陕西恒兴果汁饮料有限公司提供；展青霉素标准品，纯度≥99%，购买于上海贝基生物科技有限公司。

主要试剂有乙腈(色谱纯，纯度99.5%以上)、乙酸乙酯(分析纯，纯度99.5%以上)、乙酸(分析纯，纯度约98%)、乙醇(分析纯，纯度99.7%以上)、碳酸钠(分析纯)、海藻酸钠、无水氯化钙等。

1.2 主要仪器与设备

SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；HSQ-3型恒温水浴锅，上海福玛实验设备有限公司；UV-2550型双光束紫外可见光分光光度计、LC-2010A型高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.3 展青霉素贮备液的制备

称取5.0 mg展青霉素标准品，用乙酸乙酯充分溶解，定容至20.00 mL。将配好的展青霉素贮备液转至棕色磨口试剂瓶中，冷藏备用。

1.4 酵母菌的培养

1.4.1 酵母菌的活化 取保存的菌种于YPD平板培养基上进行划线培养，培养温度为28 ℃，培养时间为24 h。

1.4.2 一级培养 将经过24 h活化的酵母菌接种到80 mL苹果汁培养基中，28 ℃、120 r/min条件下培养24 h。

1.4.3 二级培养 将一级培养获得的种子液接种(接种量5%)到100 mL苹果汁培养基中，于28 ℃、120 r/min条件下扩大培养24 h。

1.5 固定化失活酵母的制备

1.5.1 失活酵母的制备 对扩增获得的酵母菌培养液离心、洗涤，得到酵母泥。然后在80 ℃条件下对酵母菌灭活处理45 min，得到失活的酵母菌体。

1.5.2 酵母细胞活性的鉴定 为了避免酵母对果汁产生发酵反应并保证完全是失活酵母细胞在果汁中起作用，通过美兰染色法鉴定灭活处理后酵母细胞的活性。具体操作步骤如下[15]：在载玻片中央加1滴质量分数0.1%的美兰染色液，取少许酵母粉放在染液中，混合均匀，用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，将制品放置约3 min后镜检，分别用低倍镜和高倍镜观察酵母的细胞形态、出芽及染色情况，染色0.5 h后再次观察，如果细胞无色表示是活细胞，如果细胞不褪色表示其已完全失活[19]。

1.5.3 失活酵母的固定化 采用海藻酸钠包埋法进行失活酵母的固定化[20]。具体操作步骤如下：称取1.66 g无水CaCl2，加入300 mL蒸馏水溶解，制备获得0.05 mol/L CaCl2溶液。同时，将3 g海藻酸钠加入100 mL蒸馏水中，用电磁炉缓慢加热并搅拌，将其完全溶化。将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入30 g酵母泥，充分搅拌使其混合均匀，形成海藻酸钠-酵母菌悬液，转移至配有22-G1型号针头的注射器中。以恒定的速度缓慢将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，形成凝胶珠，静置1 h，使其完全固定化。无菌去离子水洗涤固定化的失活酵母细胞，并重新加入0.05 mol/L CaCl2溶液，4 ℃下平衡备用。本试验中获得的凝胶颗粒直径为1.5～2 mm，经过5 000 r/min 离心试验测试，证明该酵母颗粒机械强度较高，具备稳定的物理性能，可满足试验的要求。

1.6 试验设计与数据处理

1.6.1 单因素试验设计 (1)固定化失活酵母剂量的影响。精确称取固定化失活酵母0，0.3，0.5，0.7，0.9 g，分别加入到30 mL加标果汁样品中，使固定化失活酵母的剂量分别为3.3，10.0，16.7，23.3和30.0 g/L，室温条件下振荡吸附，振动频率为120 r/min，吸附时间为24 h，评价固定化失活酵母剂量对展青霉素去除率的影响。(2)吸附时间的影响。分别将0.5 g固定化失活酵母加入到不同加标果汁样品中(30 mL)，于室温条件下振荡(120 r/min)吸附，分别在吸附开始的6，12，18，24 h取样，测定吸附时间对展青霉素去除率的影响。(3)展青霉素初始质量浓度的影响。分别取30 mL质量浓度分别为50，100，300，500 μg/L的加标苹果汁，加入0.5 g固定化失活酵母于室温条件下振荡(120 r/min)吸附，吸附时间为24 h，评价展青霉素初始质量浓度对苹果汁中展青霉素去除率的影响。(4)苹果汁pH的影响。以pH缓冲液调节苹果汁的pH分别为3.0，4.0，5.0，加入0.5 g固定化失活酵母，于室温条件下振荡(120 r/min)吸附，吸附时间为24 h，评价苹果汁pH对展青霉素去除率的影响。

每次吸附完成后将固定化失活酵母颗粒与果汁分离，采用HPLC法测定果汁中的展青霉素含量，每个处理设3次重复。同时，以未添加固定化失活酵母的苹果汁为空白对照。

1.6.2 Box-Behnken试验设计 通过单因素试验，确定去除展青霉素的最佳固定化失活酵母剂量、吸附时间、展青霉素初始质量浓度和苹果汁pH值，分别以X1、X2、X3、X4表示，并以1、0、-1分别代表自变量的高、中、低3个不同的编码水平。然后进行Box-Behnken试验设计，其因素和水平见表1。

表 1 固定化失活酵母去除苹果汁中展青霉素工艺的Box-Behnken试验的因素及水平

1.6.3 去除率计算 各处理样品中展青霉素去除率的计算公式为：q=(C0-Ci)/C0×100%。式中，q为固定化失活酵母对展青霉素的去除率，%；C0为吸附前样品中展青霉素的质量浓度，μg/L；Ci为吸附后样品中展青霉素的质量浓度，μg/L。

2 结果与分析

2.1 苹果汁中展青霉素去除率的影响因素

不同因素对苹果汁中展青霉素去除率的影响见图1～图4。

2.1.1 固定化失活酵母剂量 由图1可知，当固定化失活酵母剂量依次为3.3，10.0，16.7，23.3和30.0 g/L时，果汁中展青霉素的质量浓度明显下降，固定化失活酵母对果汁中展青霉素的去除率依次为43.2%，64.8%，68.8%，68.8%，68.8%。由此判断，剂量为3.3～30.0 g/L的固定化失活酵母对果汁中的展青霉素均有吸附作用，吸附效果取决于酵母剂量大小，但当固定化失活酵母剂量为16.7 g/L时，其对果汁中展青霉素的吸附达到最大，继续增加其用量不会使展青霉素的去除率进一步升高。由此确定固定化失活酵母的最佳剂量为16.7 g/L。

2.1.2 固定化失活酵母吸附时间 由图2可知，对展青霉素初始质量浓度为96.97 μg/L的苹果汁样品，用固定化失活酵母吸附6 h时，展青霉素质量浓度下降至78.64 μg/L，去除率为18.9%；吸附12 h后，展青霉素的质量浓度下降至39.08 μg/L，去除率为59.7%；当吸附时间为18 h时，展青霉素质量浓度下降至25.80 μg/L，去除率为73.39%；当吸附时间延长至24 h时，展青霉素的质量浓度为24.08 μg/L，去除率为75.17%，此时，展青霉素的吸附去除基本达到平衡，继续延长吸附时间对展青霉素去除率影响不大。因此综合考虑，确定固定化失活酵母的最佳吸附时间为18 h。

图 1 固定化失活酵母剂量对苹果汁中展青霉素去除率的影响

2.1.3 苹果汁中展青霉素初始质量浓度 如图3所示，按照30 mL样品中加入0.5 g固定化失活酵母，对展青霉素初始质量浓度为50 μg/L的苹果汁加标样品进行24 h吸附处理，展青霉素去除率达到79.12%；随着加标果汁样品中展青霉素初始质量浓度的增大，固定化失活酵母对展青霉素的去除率呈下降趋势，当展青霉素初始质量浓度为500 μg/L时，其去除率为27.38%。

图 3 苹果汁中展青霉素初始质量浓度对固定化失活酵母去除展青霉素的影响

由此得出，展青霉素初始质量浓度为50～500 μg/L时，固定化失活酵母对其均有去除作用，但是去除效果随着展青霉素初始质量浓度的不同而变化较大。随着加标样品中展青霉素初始质量浓度的升高，固定化失活酵母对展青霉素的吸附去除率呈现下降趋势，并最终达到吸附平衡。这是因为对于一定量的固定化酵母，其可以吸附展青霉素的结合位点总量是一定的，当展青霉素质量浓度逐渐增大时，固定化失活酵母吸附到的目标物增多，当展青霉素初始质量浓度增大到一定程度时，固定化失活酵母的吸附位点基本被完全结合，即使继续增大加标果汁中展青霉素的质量浓度，固定化酵母细胞对其的吸附总量也不会有太大改变。因此，本试验确定的展青霉素的最佳初始质量浓度为100 μg/L，在此条件下展青霉素去除率可以达到75.16%。

2.1.4 苹果汁pH值 由图4可知，在展青霉素初始质量浓度为96.97 μg/L的加标样品中，当苹果汁pH值为3.0，4.0和5.0时，去除率分别为46.1%，73.7%和80.8%。可见，展青霉素的去除率随着pH的增大而增加。据文献报道[16]，展青霉素在酸性条件下比较稳定，不易分解，所以苹果汁本身的酸度对固定化失活酵母去除展青霉素起着至关重要的影响。固定化失活酵母可以用于不同酸度苹果汁样品中展青霉素的吸附去除，在苹果汁pH值为5.0时具有最佳的效果。

2.2 苹果汁中展青霉素去除工艺条件的优化

2.2.1 Box-Behnken试验 在单因素试验基础上，进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计，对苹果汁中展青霉素去除工艺进行优化，结果见表2。

表 2 固定化失活酵母去除苹果汁中展青霉素工艺的Box-Behnken试验结果

利用Desingn-Expert 7.0软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到的二次多项回归模型方程为：

表 3 苹果汁中展青霉素去除率与其影响因素回归模型的方差分析结果

2.2.2 各因素交互作用对展青霉素去除的影响 固定2个因素水平，分别考察其余2个因素对展青霉素去除率的影响，得到展青霉素初始质量浓度(X1)和苹果汁pH值(X2)、吸附时间(X4)和固定化失活酵母剂量(X3)对展青霉素去除率(Y)的影响如下式所示：

图5和图6分别为固定化失活酵母吸附去除苹果汁中展青霉素的过程中，展青霉素初始质量浓度与苹果汁pH值、吸附时间与固定化失活酵母剂量之间交互作用对展青霉素去除率影响的响应面曲线。由图5可知，当固定化失活酵母剂量为16.7 g/L、吸附时间为18 h时，等高曲线沿X2(苹果汁pH值)方向变化较快，呈抛物线形式变化，而沿X1(展青霉素初始质量浓度)方向变化较慢，表明在本试验水平下，苹果汁pH值对去除率的影响较展青霉素初始质量浓度明显。由图6可知，当苹果汁pH值和展青霉素初始质量浓度分别为4.0和100.0 μg/L时，等高曲线沿X4(吸附时间)方向变化较快，呈抛物线形式变化，而沿X3(固定化失活酵母剂量)方向变化较慢，提示在试验水平下，吸附时间对去除率的影响较固定化失活酵母剂量明显。

2.2.3 展青霉素的最佳去除工艺 利用SAS 9.1软件分析得到固定化失活酵母去除苹果汁中展青霉素的最佳工艺条件为：展青霉素初始质量浓度 90.52 μg/L，苹果汁pH=4.46，固定化失活酵母剂量15.13 g/L，吸附时间18.16 h，在此条件下，固定化失活酵母对苹果汁中展青霉素的去除率为72.89%。对上述优化条件进行试验验证，可知展青霉素的去除率为71.36%。

图 5 展青霉素初始质量浓度、苹果汁pH及其交互作用对固定化失活酵母去除苹果汁中展青霉素的影响

3 结 论

1)以单因素试验为基础，利用响应曲面法对影响固定化失活酵母去除苹果汁中展青霉素的关键因子及其交互作用进行分析，结果表明，各因素对展青霉素去除率的影响由小到大顺序为展青霉素初始质量浓度<固定化失活酵母剂量<吸附时间<苹果汁pH值。优化获得的固定化失活酵母去除苹果汁中展青霉素的最佳工艺条件为：展青霉素初始质量浓度90.52 μg/L，苹果汁pH=4.46，固定化失活酵母剂量15.13 g/L，吸附时间18.16 h。在此条件下，展青霉素的去除率为71.36%。

2)与传统展青霉素去除方法相比，采用固定化失活酵母去除苹果汁中展青霉素时，该方法具有高效快捷、成本低廉的特点，且极大提高了苹果汁的安全性，因此该方法具有很强的实用价值，其产业化应用前景极为广阔。

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