醋酸铅对小鼠的急性毒性效应

2014-03-26 11:26孙相和宁红梅陈玲丽孔令芸葛亚明
关键词:醋酸灌胃脏器

孙相和,宁红梅,李 冲,陈玲丽,孔令芸,葛亚明

(河南科技学院 动物科学学院,河南 新乡 453003)

铅(Lead,Pb)是一种多亲和性有毒重金属,在日常生活中被广泛应用于工农业生产中。虽然铅及其化合物在工农业生产中发挥着重要作用,但会对人和动物体产生毒害作用。误食含铅物质或者吸入铅及其化合物,都可引起铅中毒,其对机体各系统均能造成严重损伤[1-2]。有研究表明,铅对儿童智力和生长发育危害严重,特别对记忆能力的损害尤为明显[3]。铅毒性持久,半衰期长,不易排出体外,在动物体内容易富集,人食用铅富集动物的肉类产品会对人体产生不利影响。铅不是动物体生长必需的元素,且可对动物体产生累积性毒害作用[4]。因此,动物体内理想状态下铅含量应为零[5]。

目前,铅的广泛应用使人和动物的生活环境受到其严重污染[6-7],并已严重威胁人类和动物的健康。有调查显示,铅在职业性慢性中毒中排行首位[8]。铅对儿童大脑功能的损伤效应往往是长期且不可逆的[9-10],其对神经系统血脑屏障的损害使得儿童和幼龄动物产生认知缺陷[11]。另外,铅对动物免疫和生殖方面的损害也得到越来越多的关注[12-14]。然而,关于铅中毒对动物体整体损害的研究尚未见报道。为此,本研究进行了对小鼠灌胃醋酸铅的急性毒性试验,以评价醋酸铅对小鼠的急性毒性效应,为深入研究铅的毒性作用机制、明确铅毒性作用的靶器官、提高人类对铅毒性的认识提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物 昆明种健康小鼠164只,4周龄,雌雄各半,由河南新乡医学院实验动物中心提供。小鼠每笼饲养5只,自由饮水,饲养环境温度(24±2) ℃,相对湿度42%~57%。

1.1.2 试剂与仪器 醋酸铅[(CH3COO)2Pb·3H2O],分析纯,购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司,批号:20120413,使用时用去离子水配制成不同浓度。电子天平,购自赛多利斯科学仪器有限公司;Leica RM 2235轮转式切片机,购自Leica Microsystems Nussloch GmbH;Leica DMIL LED显微镜及其照相系统,购自徕卡显微系统贸易有限公司。

1.2 方 法

试验前对小鼠进行为期1周的适应性饲养观察,观察期内小鼠自由采食、饮水和活动。

1.2.1 醋酸铅半数致死剂量(LD50)的测定 预试验:将小鼠随机分为6组,每组4只,雌雄各半,各组醋酸铅剂量分别为1 000,2 000,4 000,8 000,16 000和32 000 mg/kg,以小鼠平均体质量计算,按20 mL/kg 剂量灌胃给药,观察临床症状并记录死亡情况,判断0致死量的醋酸铅剂量(LD0)和全数致死量的醋酸铅剂量(LD100)。根据给药剂量,按公式i=(LD100-LD0)/(n-1)确定正式分组剂量公比r的对数i,并计算出剂量公比r=lg-1i,其中n为预分组数。

正式试验:据预试验得出的结果,将小鼠随机分为6组,每组10只,雌雄各半,按给药剂量由低到高分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组,按1/r等比稀释法配制等比浓度醋酸铅溶液,按20 mL/kg剂量灌胃给药,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组醋酸铅的灌胃剂量分别为4 033.7,5 762.4,8 232.0,11 760.0,16 800.0,24 000.0 mg/kg,统计36 h内小鼠的死亡情况。利用Bliss法计算LD50及其95%可信限。

1.2.2 醋酸铅对小鼠体质量及脏器指数的影响 将小鼠进行随机分组,共分4组,每组20只,雌雄各半,根据攻毒剂量依次分为对照组、低铅组、中铅组和高铅组,各组分别饮用醋酸铅浓度为0,2.4,4.8和9.6 mmol/L的去离子水[15],饮毒时间9 d。分别于自由饮水染毒后0和9 d测定试验小鼠体质量,记为初始体质量和终末体质量,并记录体质量变化程度。试验结束时(10 d),统计存活的小鼠数,采用颈椎脱臼法处死小鼠,解剖观察后取出各脏器,用吸水纸吸去污血,称取各脏器的质量,以脏器质量/100 g体质量的比值表示各脏器指数。

1.2.3 醋酸铅对小鼠脏器影响的病理组织学检查 对观察期内死亡的小鼠进行剖检,并在试验结束时,对全部存活小鼠进行解剖检查,解剖检查前24 h禁食不禁水,检查组织器官是否存在明显病理变化。同时采集小鼠的大脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏组织,固定在体积分数10%中性福尔马林溶液中,并将组织脱水、包埋、切片、常规HE染色,进行病理组织学检查,以考察醋酸铅对各内脏器官的急性毒性效应。

1.3 数据处理

试验数据采用“平均值±标准差”表示,应用SPSS 17.0和Excel 2003软件对数据进行统计分析[16]。

2 结果与分析

2.1 醋酸铅对小鼠的半数致死剂量(LD50)

预试验初步确定0致死和全数致死量的醋酸铅剂量分别为4 000和24 000 mg/kg,i=0.156,r=1.43,1/r=0.7,据此醋酸铅溶液的灌胃剂量由高到低依次为24 000.0 mg/kg剂量组(Ⅵ组)、16 800.0 mg/kg剂量组(Ⅴ组)、11 760 .0 mg/kg剂量组(Ⅳ组)、8 232.0 mg/kg剂量组(Ⅲ组)、5 762.4 mg/kg剂量组(Ⅱ组)和4 033.7 mg/kg剂量组(Ⅰ组)。

急性毒性试验中,灌胃后1 h小鼠开始出现死亡,36 h内小鼠死亡情况见表1。利用Bliss法计算醋酸铅经口灌胃LD50的回归方程为y=-15.328+5.052 1lgx,其中y为醋酸铅对小鼠的致死概率,x为醋酸铅灌胃剂量的常用对数值,半数致死剂量LD50=10 562 mg/kg,LD5095%的可信限是8 609.4~3 023 mg/kg (Feiller校正),LD5=4 990.6 mg/kg,LD95=22 353 mg/kg。

表 1 不同剂量醋酸铅灌胃36 h内小鼠的死亡情况(n=10)

2.2 醋酸铅对小鼠体质量和脏器指数的影响

醋酸铅对小鼠体质量、脏器指数的影响见表2和表3。由表2可知,各组间小鼠初始体质量差异不显著(P>0.05),随着试验过程中对醋酸铅饮用量的增加,个别小鼠发生应激性死亡,试验结束时,各组间小鼠的终末体质量差异不显著(P>0.05)。对照组和中铅组小鼠终末体质量与初始体质量差异极显著(P<0.01),高铅组小鼠终末体质量与初始体质量差异显著(P<0.05),低铅组小鼠的终末体质量与初始体质量差异不显著(P>0.05)。各组间小鼠终末体质量与初始体质量的变化差异也不显著(P>0.05)。

表 2 醋酸铅对小鼠体质量的影响(n=20)

表 3 醋酸铅对小鼠脏器指数的影响

由表3可知,小鼠大脑指数随着醋酸铅剂量的增加呈降低趋势,小鼠心脏指数、脾脏指数和肾脏指数随醋酸铅剂量的增加总体呈升高趋势,肺脏指数和肝脏指数的变化无规律性。与对照组相比,低铅组小鼠肾脏指数显著升高(P<0.05),中铅组和高铅组小鼠肾脏指数极显著升高(P<0.01);醋酸铅处理组与对照组其他脏器指数的差异均不显著(P>0.05)。

2.3 醋酸铅处理小鼠脏器的病理剖检

对观察期内死亡小鼠进行剖检,并在试验结束时,对全部存活小鼠进行剖检,观察小鼠的病理组织学变化,结果见图1。

图 1 醋酸铅处理小鼠的病理组织学变化 (×400)

2.3.1 一般剖检变化 与对照组相比,染毒组小鼠精神沉郁,反应迟钝,行动缓慢。饮用醋酸铅1 d后,低铅组小鼠死亡1只,剖检观察各组织器官无明显变化,与对照组小鼠组织器官相似;高铅组小鼠分别在饮用醋酸铅第6天和第8天共死亡3只,死亡小鼠心脏肿胀,脾脏有出血现象且体积增大,肾脏明显肿大且质地变软,大脑、肺和肝脏剖检变化不明显。与对照组相比,染毒组小鼠心脏、脾脏和肾脏体积均有不同程度的增大,其中高铅组小鼠心脏、脾脏和肾脏体积增大较明显,其他组织器官剖检变化不明显。

2.3.2 病理组织学变化 由图1可见,对照组小鼠大脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏组织无异常变化。随着醋酸铅剂量的增加,染毒小鼠大脑皮层颗粒细胞数量减少,神经纤维萎缩断裂,并有缠结现象(图1-A4);心肌纤维间隙扩张,肌纤维出现断裂(图1-B4);高铅组小鼠肺泡变化明显,肺泡壁有聚集粘连现象(图1-C4),其他组与对照组无明显差别;肝脏小叶结构紊乱,肝索排列混乱且有断裂现象,窦状隙扩张,肝细胞大小不均匀,细胞有空泡化现象(图1-D4);随着醋酸铅剂量的增加,小鼠脾脏出血现象逐渐明显,红髓白髓界限不明显,巨噬细胞数量减少(图1-E4);肾脏近曲小管管腔收缩,致密斑数量增加,刷状缘不明显(图1-F4)。

3 讨 论

半数致死剂量(LD50)是指在规定时间内,通过特定感染途径,使某种试验动物半数死亡所需化学物质的最小剂量,是描述化学物质毒性强弱的常用指标。目前可以采用很多方法计算LD50,但Bliss法最为准确。本试验利用Bliss法软件计算醋酸铅[(CH3COO)2Pb·3H2O]的LD50为10 562 mg/kg,95%可信区间为8 609.4~3 023 mg/kg,依据《我国工业化学物急性毒性分级标准》[17],该物质为低毒。

体质量是反映机体发育是否正常的标志。本试验结果表明,在醋酸铅急性染毒期间,小鼠体质量变化与染毒情况关系不明显,并没有随着染毒剂量的增加而发生显著变化。脏器指数是反映实验动物器官功能是否正常的重要指标,在毒理学试验中可依据化学物质对脏器的影响初步判断其毒性。本试验中,随着醋酸铅剂量的增加,小鼠心脏指数、脾脏指数和肾脏指数总体升高,其中以肾脏指数升高趋势最显著;大脑指数则降低,而肺脏指数和肝脏指数的变化无明显规律性。

大量研究表明,铅对动物体的损害是全身性的,其能损害多种组织和器官[18-20]。本试验中,醋酸铅急性染毒后,剖检小鼠的心脏、脾脏和肾脏有肿大充血现象,其他组织器官剖检变化不明显;病理组织学分析表明,小鼠大脑、心脏、肺、肝脏、脾脏和肾脏均有病变发生,其中只有高铅组小鼠肺组织有明显病理变化,而低铅组和中铅组小鼠肺无病理变化,推测消化道染毒对小鼠肺的毒性效应可能存在一定的制约性。本试验结果进一步验证了铅对动物多组织、多器官均有损伤作用,这为以后研究铅对机体整体损伤提供了依据。

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