荧光素钠滴眼液微生物限度检查的验证

张锦兴 李运景 李卓亚

微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目。为确保微生物限度检查方法的科学性和检验结果的准确性，从2005年开始至现行2010年版《中国药典》规定药品的微生物限度检查应进行方法学验证[1]。荧光素钠滴眼液是中山市人民医院配制的供院内使用的常用制剂，由荧光素钠和碳酸氢钠组成，临床用于眼角膜损伤和角膜溃疡的诊断，为确保检验方法的准确性和可靠性及保证患者用药安全、有效，对该品种微生物限度检查进行了计数方法及控制菌检查方法的验证[2]。

1 仪器与试药

1.1仪器 CS101-1EB电热鼓风干燥箱(JS029)，DHP-600电热恒温培养箱(JS031)，SHH-250L电热恒温培养箱(JS039)。

1.2培养基 营养琼脂培养基(批号：3101692，广东环凯微生物科技有限公司)，玫瑰红纳琼脂(批号：120717，北京陆桥技术有限责任公司)，胆盐乳糖培养基(批号：3101620，广东环凯微生物科技有限公司)，pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：201010153，广东环凯微生物科技有限公司提供)。

1.3菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕、大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)〔CMCC(B) 63 501〕、白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕、黑曲霉菌(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕。以上菌种由杭州微球生物技术有限公司提供为微生物培养基控品。

1.4药品 荧光素钠滴眼液(中山市人民医院生产，批号：20130520,20130721,20130922)。

2 方法与结果

根据《中国药典》2010版二部附录XI J 微生物限度检查法进行验证试验。

2.1菌落计数方法的验证

2.1.1菌液制备 使用前注入1.1 ml稀释液溶解，混匀使用。

2.1.2供试液制备 取供试品10 ml，加pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，作为1 ∶ 10供试液。

2.1.3验证方法 ①试验组：取1 ∶ 10供试液1 ml分别注入10个平皿中，再依次加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌5种菌的菌悬液各1 ml(菌数为50～100cfu/ml)，每株菌平行制备2个平皿，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置30～ 35℃培养48 h和23～28℃培养72 h。②菌液组：分别取上述稀释的菌液1 ml注入平皿内，每个菌株平行制备2个平皿，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置30～35℃培养48 h和23～28℃培养72 h。测定所加的实验菌数。③供试品对照组：取1 ∶ 10供试液1 ml按试验组方法(不加试验菌)，测定供试品的本底菌数。④标准规定：试验组的回收率应不低于70%[3]。

2.1.4结果 以上试验结果表明，采用平皿法检验荧光素钠滴眼液，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均大70 %。因此，荧光素钠滴眼液的细菌、霉菌、酵母菌数的测定可采用平皿法进行，试验结果见表1。

2.2控制菌检查方法验证[4]大肠埃希菌检查，结果见表2。

2.2.1阳性对照试验 取1 ∶ 10供试液10 ml和10～100 cfu的大肠埃希菌，同时接种至100 ml胆盐乳糖培养基中，依据大肠埃希菌检查法试验。

2.2.2阴性对照试验 取1 ∶ 10供试液10 ml和10～100 cfu的金黄色葡萄球菌，同时接种至100 ml胆盐乳糖培养基中，依据大肠埃希菌检查法试验。

2.2.3供试品对照组 取1 ∶ 10供试液10 ml，接种至100 ml胆盐乳糖培养基中依据大肠埃希菌检查法试验。

表1 荧光素钠滴眼液细菌数、霉菌和酵母菌数计数三次验证试验结果

表2 大肠埃希菌检查验证结果

注：“+”： 紫外灯光下呈荧光及MUG反应呈阳性； “-”： 紫外灯光下不呈荧光及MUG反应呈阴性

上述方法阳性对照组检出了大肠埃希菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，供试品组未检出大肠埃希菌。说明验证方法通过。

3 讨论

3.1验证试验结果表明荧光素钠滴眼液无抑菌作用，可直接取样按常规方法进行微生物限度检查。

3.2微生物限度方法学验证试验中所用的标准菌种的传代次数不得超过5代，并需要定期进行菌种鉴定，以检查菌种有无变异或污染，保证验证结果的准确性。

3.3用常规法进行计数验证时，在加供试品与菌液至平皿时应将其尽可能点散开，即用点注的方法使其均匀地分布于整个平皿，倾入培养基后充分摇匀，这样不容易出现供试品与菌液分散不均致回收率计数重现性不高的现象[5]。

3.4枯草芽孢杆菌在平皿上生长时容易粘连成片，影响计数，可将50～100 cfu菌液于平皿上充分点散开，倒入琼脂后充分摇匀后，菌落呈点状，易于计数[6]。

[1] 国家药典委员会. 《中国药典》二部. 中国医药科技出版社, 2010, 附录XIJ.

[2] 高捷. 复方甘草口服溶液微生物限度检查法验证实验. 中国医药导报,2008,19(5) : 30-31.

[3] 国家药典委员会.《中国药典》. 二部. 中国医药科技出版社, 2010，附录XIJ: 108-109.

[4] 国家药典委员会.《中国药典》. 二部. 中国医药科技出版社, 2010，附录XIJ: 111.

[5] 张婷,郑绍忠,刘全芳.复方呋喃西林滴鼻液微生物限度检查的验证.中国药房，2011, 22(45): 4274-4276.

[6] 张婷, 郑绍忠, 刘全芳. 盐酸麻黄碱滴鼻液微生物限度检查的验证. 海峡药学，2011, 23(1): 53-54.