富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISPs)在哺乳动物授精过程中的作用

丹 彤， 黄文强， 白 雪， 邢万金

(内蒙古大学生命科学学院 哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室, 呼和浩特 010021)

哺乳动物的授精过程由精子成熟、获能、精卵结合与融合等一系列事件组成，是个复杂而又有序的事件，涉及精子和卵子上的很多特异性蛋白和脂质分子。在众多与精卵黏附和融合有关的蛋白分子中，研究较多的是精子表面的蛋白，如IZUMO家族中的IZUMO1蛋白、ADAMs(a disintegrin and metalloprotease)家族中的受精素和Cyritestin、PDI(Protein disulfide isomerase)家族中的PDIA3 (ERP57)、CRISPs(cysteine-rich secretory proteins)家族蛋白、SPESP1(Sperm equatorial segment protein 1)、Equatorin、TMEM190 (Transmembrane protein 190)、SPACA (Sperm acrosome associated)家族的SPACA3 (SLLP1)、TSSK6(testis-specific serine/threonine kinase 6)等10多种[1]。其中CRISPs家族蛋白最初发现于一些啮齿动物的雄性生殖道组织中，后来在其它哺乳动物、七鳃鳗、非洲爪蟾和毒蛇等脊椎动物中均发现，是一类在进化上比较保守的分泌蛋白，其成员的氨基酸序列也高度同源。CRISP1、CRISP2均发现能与卵子表面直接结合，并影响精卵融合，是一类对于哺乳动物生殖极为重要的分泌蛋白。本实验室近年来克隆并研究了羊、牛CRISP家族成员的cDNA及其与其它精卵融合相关蛋白相互作用，取得了若干原创性发现。本文将从CRISP家族蛋白的结构与功能组织分布与行为特性，来阐述该家族蛋白在精子成熟、获能、精卵结合与融合等不同事件上所扮演的重要角色和可能的分子作用机制。

1 CRISPs家族蛋白的结构与功能

CRISPs家族蛋白成员最显著的特点是富含半胱氨酸，其中有16个半胱氨酸残基位置高度保守 (图1)。根据其氨基酸序列同源性和组织分布特性，哺乳动物的CRISPs蛋白可以被分为4个亚类，分别是CRISP1、CRISP2、CRISP3和CRISP4[2-4]，这几类蛋白均已证明在精子成熟、获能以及精卵结合与融合过程中具有重要作用[4， 5]。

CRISPs家族蛋白是CAP蛋白超家族(CRISPs,Antigen 5 proteins, Pathogenesis-related proteins)中的一部分，在其蛋白N端具有大约160个氨基酸的高度保守的CAP结构域,是该超家族蛋白共有的结构域，C端有一个富含半胱氨酸的结构域(CRD，cysteine rich domain)，称为CRISP结构域，是CRISPs家族特有的结构[6-8]。 CAP结构域的结构和氨基酸序列与植物中与病原体侵袭响应机制有关且具有杀菌能力的发病机制相关蛋白(pathogenesis-related proteins)类似，因而也被称为PR-1(pathogenesis-related proteins of group 1)结构域。在这个结构域中有6个保守的半胱氨酸残基，形成3个二硫键，对维持CAP结构域独特的类似α-β-α的折叠结构稳定性有重要作用[7， 9]。 在大鼠的CRISP1蛋白的CAP结构域中存在着两个进化上保守的基序S1(signature 1)与S2(signature 2)。人工氨基酸缺失突变研究表明由12个氨基酸构成的S2基序正是CRISP1蛋白与卵子表面结合的位点[10](图2)。多数CAP超家族蛋白都在CAP结构域的N端有一段典型的信号肽序列，因此属分泌蛋白，可能通过诸如离子通道闸门或激活细胞表面受体之类的途径参与细胞信号传导调节，也有可能修饰其它蛋白，参与细胞外基质的重塑或细胞的粘附[9]。从织锦芋螺(Conus textile)毒液管里分离出的CRISP同源蛋白Tex31具有蛋白水解活性[11]，暗示PR-1结构域可是蛋白酶的组成模块，但是在以后的研究中并没有发现其它CRISP蛋白具有酶活性。CRISP蛋白的CRISP结构域由铰链区(hinge region)和离子通道调节区(ICR，ion channel regulatory)组成(图2)，铰链区连接着N末端的CAP结构域和C末端的ICR结构域。铰链区中包含4个保守的半胱氨酸残基，形成2个二硫键，ICR区有6个保守半胱氨酸残基，形成3个二硫键，如小鼠CRISP1(Uniprot Q03401):C190↔C197、C193↔C202、C206↔C239、C215↔C233、C224↔C237；CRISP2(Uniprot P16563):C199↔C196、C192↔C201、C205↔C238、C214↔C232、C223↔C236；CRISP3(Uniprot Q03402):C194↔C201、C197↔C206、C210↔C241、C219↔C235、C226↔C239；这些交错的二硫键对于该结构域的稳定和功能具有重要意义[12， 13]。CRISP结构域内的6个保守性半胱氨酸残基间的二硫键使肽链折叠，形成了独特的具有离子通道调节活性的沟壑结构[8]，在爬行类和哺乳类中[14]，都具有离子通道调节活性，例如K+、Ca2+通道抑制性[7， 12]。生殖道中以及精子表面分布的CRISP蛋白也具有离子通道调节活性，而精子获能依赖于环境中的离子浓度[15]，因此推测哺乳动物的CRISP蛋白可能与精子获能有关。

2 CRISPs家族各成员的结构与功能

2.1 附睾的CRISP1蛋白

CRISP1(DE， AEG)是最早在大鼠附睾中发现的一种雄性激素剂量依赖性分泌蛋白，附睾头近端的上皮细胞合成并分泌CRISP1，精子在附睾中储运时，CRISP1蛋白黏附到精子头部，定位于大鼠精子头部背侧区域。

附睾分泌的CRISP1既有全长氨基酸链的完整CRISP1，也有一部分被蛋白酶水解加工后形成两种不同形式的CRISP1蛋白，第一种形式是蛋白D，分子量较大，约32 kDa，它是附睾中CRISP1的最主要的形式，以松散、可逆的方式同精子表面相结合，容易被离子溶液脱去；另一种形式是蛋白E，分子量较小，约22 kDa，同精子表面紧密结合[16]，推测这种形式的CRISP1蛋白可能是C末端的CRISP结构域被剪掉的CRISP1蛋白剪接体[13]。CRISP1在精子上可能有其特殊的受体，当精子离开睾丸进入雌性生殖道后，D形式的CRISP1从精子表面释放，而E形式的CRISP1仍结合于精子表面，并重新定位，迁移到精子头部的赤道段区域[13]。鉴于这个区域正是精子头部与卵子膜融合的起始区域，CRISP1可能还参与精卵融合过程[17]。原核表达的重组大鼠CRISP1能与卵子质膜直接结合[10]，而且与卵结合的活性部位限定在PR-1结构域范围中的45个氨基酸区(114-158)，这个区域包含了两个CRISP家族的特征基序，分别是S1(signature 1)和S2(signature 2)。实验结果确定了大鼠CRISP1的S2区域与卵结合的关联性[10]。但敲除CRISP1基因的小鼠并不影响生殖，只降低了精子穿过透明带和与卵融合的能力[18]，可能是CRISP2补充了CRISP1的功能。目前还有待于进行CRISP1和CRISP2双敲除小鼠实验，观察CRISPs对精卵融合的影响。

CRISP2最初被命名为睾丸特异性蛋白1(testis-specific protein 1, Tpx-1)，特异性表达于睾丸及其精细胞上。人和小鼠的CRISP2蛋白是顶体内部的蛋白，在顶体反应后仍然留在精子上[19]。在小鼠配子共孵育时加入CRISP2多克隆抗体，导致精子进入去透明带卵的穿透率显著下降，且呈剂量依赖效应[19， 20]。CRISP2抗体也能显著地降低精子穿透卵子透明带的穿透率，但最引人注目的是穿过透明带的精子积聚在卵周隙，说明抗体并未损害精子的能动性和顶体反应，只是抑制精卵融合，即CRISP2在精卵融合阶段起作用20。此外，原核表达的重组CRISP2能与去透明带的人卵子结合[19]。原核表达的重组小鼠CRISP2同CRISP1一样，在卵的成融区域具有结合位点，证实了卵表面存在这两种蛋白的共同结合位点[20]。暗示在同源分子间存在着功能合作或冗余，以确保成功授精。本实验室近年来发现羊CRISP2能够与另一种精卵融合相关蛋白PDIA3相互结合(未发表)，暗示CRISP2在精子上参与精卵融合复合体的形成。

2.3 组织多样性的CRISP3蛋白

CRISP3首先在小鼠和人体的唾液腺组织中被发现。CRISP3在唾液腺中的表达呈现比较强的雄性激素依赖性，在雌性唾液腺中也检测到微弱的表达[21]。后来发现CRISP3也表达于小鼠的前B细胞、人的中性白细胞、胸腺、胰腺、泪腺、唾液腺、卵巢、前列腺等组织中[21]，具有组织多样性。人CRISP3蛋白广泛存在于外分泌腺体及免疫系统中，暗示CRISP3蛋白可能对病原体入侵等病理应答方面具有免疫保护功能，CRISPs家族蛋白在N末端具有一个与植物致病相关蛋白类似的PR-1结构域，也是对CRISP3可能参与免疫功能的支持。

人附睾中的CRISP3是由附睾上皮分泌细胞合成，在附睾尾腔和输精管中浓度最高。精液中的CRISP3主要源自附睾下游的附属生殖组织，如输精管和前列腺[22]。目前尚无实验确认CRISP3在生殖过程中的作用，只推测可能与精子成熟有关，或者可能类似CRISP1那样参与了配子融合时的相互作用[23-25]。

CRISP3 在人的正常前列腺中低水平表达，而在癌性的前列腺中超表达，显示CRISP3可能与细胞癌变有关。因此可以将CRISP3作为一种检测前列腺癌的生物标记[25， 26]。但是CRISP3在其它癌组织中并不高表达，例如在慢性胰腺炎组织中虽然比在正常胰腺组织中表达水平高，但在胰腺癌细胞系中没有检测到表达，在其它癌性的胃肠道组织中表达也并不高[27]。尽管CRISP3在这些病理组织中的活性机制仍不清楚，但也暗示着CRISP3蛋白在生殖过程之外也扮演重要的角色。

2.4 附睾的CRISP4蛋白

CRISP4目前只发现于大鼠和小鼠的体内，分布于在附睾的多个区域，在附睾体和附睾尾的含量最丰富，在这里向成熟的精子上粘附，与精子的成熟有关联[2， 3， 28， 29]。除了在雄性生殖道中外，在卵母细胞、骨骼肌、脾脏、胸腺中也发现了低量表达的CRISP4蛋白[3， 30]。大鼠CRISP4和小鼠CRISP4间有91%的相似性，与人类的CRISP1同源，可能与人CRISP1有着功能相似性，作为抑能因子起作用[9]，但目前关于CRISP4的确凿功能及在CRISP家族中的角色和地位尚没有充足的研究。

3 展望

自从在哺乳动物中发现CRISPs分泌蛋白以来，对CRISPs 家族的研究已经取得了长足的进展,积累了很多物种的CRISPs成员的cDNA序列、蛋白结构等基本生物学与功能资料，尤其是它们在生殖过程中的作用。近年来发现CRISP1和CRISP2都能与卵子直接结合，引发了人们对其直接参与精卵结合和融合的关注和分离位于卵子表面的潜在结合配体的兴趣。 由于CRISPs家族成员在氨基酸序列上的高度同源性和功能的相似性，人们认为它们可能以功能互补形式共同参与精子与卵子结合，这给单独研究某个成员的作用分子机制带来了困难。未来的工作仍然需要进一步敲除CRISP基因，包括同时敲除两个CRISP基因来鉴定他们对应的生殖作用。其次要揭示CRISPs与其它精卵融合相关蛋白之间的相互作用，从而推测它们在影响精卵融合的蛋白复合体或者相互作用链中所起的作用。

哺乳动物精卵融合的分子机制是个极为重要的生命科学基础问题，但由于目前在技术上还不能在体外长期培养并诱导生殖母细胞产生配子，也不能培养哺乳动物的单倍体配子细胞，所以难以解析精子与卵子结合和融合的精细过程以及筛选影响这些关键过程的因子。未来的突破方向当务之急是性母细胞培养和诱导分化的技术，其次是改变研究策略，改为研究已知的若干种精卵融合相关蛋白之间的相互作用，找出它们之间的作用方式，推测它们在精卵融合过程中的作用模式。

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