棉花三元杂种的细胞遗传学研究

张鹿飞，陈弟， 吴玉香

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801;2.中国农业科学院 棉花研究所，河南 安阳 455000)

棉属(Gossypium)为被子植物锦葵目(Malvales)、锦葵科(Malvaleae)、棉族(Gossypiceae)。最新提出的棉属分类系统为4个亚属，共51种(亚种)[1]，其中包括46个二倍体种(2n=2x=26)和5个四倍体棉种(2n=4x=52)，即陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)、毛棉(G.tomentosum)、黄褐棉(G.mustelinum)、达尔文棉(G.darwinii)，四倍体棉种是由二倍体A、D组棉种杂交后加倍形成的。

种质资源是棉花育种的重要基础。棉属野生种具有抗病虫，耐干旱、盐碱和纤维品质优异等特性。远缘杂交是人工合成新种与新种质的重要手段，长期以来棉花育种家做了大量的尝试并取得了较大的进展，大量的远缘杂交研究通过探索把不同物种的有益性状进行重新组合，以期创造出近缘杂交无法得到的优异特性，为棉花新种质的创造提供了新的途径[2]。庞朝友等[3]收集了155份棉属种间杂交渐渗系，对主要农艺性状的鉴定结果表明，不同野生种在陆地棉优质纤维、抗病、抗逆和抗虫种质改良上发挥了不同的作用。澳洲棉原产澳洲西部，分布于Carpentar湾海岸和昆士兰的山中[4]，为C3染色体组的二倍体野生棉。Fryxell[5]发现其具有种子无腺体、植株有腺体的特性，抗或耐棉蚜、红蜘蛛，抗干旱，具有提高衣分及纤维成熟度的潜力[6]。黄褐棉原产南美洲，分布于巴西东北部，为异源四倍体野生棉，黄褐棉在3个野生四倍体棉种中与陆地棉距离最远[7]，因此最有可能存在一些新的基因位点，可以用于陆地棉的遗传改良。顾本康等[8]初步鉴定结果表明，澳洲棉、黄褐棉对黄萎病均表现免疫。

本研究试图通过远缘杂交将野生澳洲棉和黄褐棉的优良性状导入陆地棉，用来改良栽培种陆地棉，并通过杂种减数分裂行为来探讨其育性，以期寻求育性恢复的有效方法，为棉花遗传育种及新种质创新提供理论依据和中间材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

陆地棉(G.hirsutum)(2n=4x=52)，C组野生澳洲棉(G.australe)(2n=2x=26)，AD组野生黄褐棉(G.mustelinum)(2n=4x=52),均取材于国家种质三亚野生棉圃。

表1 供试材料及其地理分布

三元杂种合成过程：

1.2 三元杂种F1的减数分裂观察

1.2.1 取材与固定

棉花长出花蕾后，用镊子于不同时间(8:00、8:30、9:00)采集正在生长的不同大小的花蕾，并将花蕾放入盛有卡诺固定液的广口瓶中，固定液种类很多，常用的是卡诺固定液，其配方为95%酒精和冰乙酸(3∶1)，随配随用。固定时间12～24 h，固定后用70%的酒精保存，置于4℃冰箱冷藏待用。

1.2.2 制片

将花蕾从广口瓶中取出，放于干净的滤纸上，用镊子和解剖针轻轻将花蕾撕开；取其中4～7粒花药，放到清洗干净的载玻片上，加一滴卡宝品红后,用镊子轻轻挤压，以使花药中的花粉母细胞游离出来。用镊子垂直将载玻片上肉眼可见的杂质去掉，取一盖玻片轻轻盖上。在酒精灯上方烘烤(以不沸腾为限)，然后立即用滤纸卡住，用大拇指垂直重压。

1.2.3 镜检

用OLYMPUS DP71显微镜观察花粉母细胞减数分裂行为，将视野中好的分裂相进行照相并封片保存，备用。

1.2.4 统计分析

花粉粒的观察与统计：选200个视野进行观察，记录杂种花粉粒中正常与异常花粉粒的数目，分别计算其比率。

小孢子形态特征的观察：分别选取100个视野，记录不同孢子的形态及数目，并计算比率。

2 结果与分析

2.1 花粉粒的观察与统计

正常花粉粒饱满，形态大小一致，如亲本二倍体澳洲棉花粉粒；三元杂种花粉粒形状不规则，且大小不等，有的形状饱满，但没有生活力，花粉粒棘状物小，短而粗(图1-A)，也存在不完整的破裂花粉粒。对200个视野中的1189个花粉粒的统计结果(表2)表明，三元杂种正常的花粉粒只占46.1%，具有生活力的花粉粒更少，大部分为异常花粉粒。这是三元杂种不育的主要原因。

2.2 小孢子发育期及分裂后期的观察

三元杂种的花粉母细胞，在减数分裂后期Ⅱ染色体向多极移动(图1-B、C),从而形成多分孢子，在统计的100个视野的322个多分孢子中，大多出现微核，每个母细胞中微核数目在1～5不等，五分体大多是4大1小，六分体大多是4大2小(图1-D)。

表2三元杂种花粉粒类型统计

Table2 Statistic analysis of pollen type for trispecific hybrid

类型Type数量Number百分比Percentage/%正常54846.1不正常64153.9花粉粒总数1189100

三元杂种与亲本的多分孢子统计见表3，亲本澳洲棉正常四分体占59.5%；黄褐棉正常四分孢子占65.5%；三元杂种中大部分为六分体(48.7%)，正常四分孢子仅占8.4%，且多数四分孢子含微核，出现5～8个不等的多分孢子(图1-E、F)，且平均孢子数为5.87。

图1 三元杂种的减数分裂行为Fig.1 Meiosis behavior of trispecific hybrid注：A为三元杂种不规则花粉粒；B和C为三元杂种减数分裂后期Ⅱ染色体向多极移动；D～F为三元杂种多分孢子Note:A:abnormal pollen grain of trispecific hybrid;B and C:chromosome segregation to different directions at anaphase II in meiosis;D～F:multispores of trispecific hybrid.

材料Materials类型Type2Two3Three4Four5Five6Six7Seven8Eight9Nine10Ten11Eleven总计Total异源六倍体数量151994181200000158频率/%9.51259.511.47.600000100小孢子总数3057376907200000625黄褐棉数量00108391350000165频率/%0065.523.67.930000100小孢子总数0043219578210000726F1杂种数量18027251578213000322频率/%5.608.47.848.725.54000100小孢子总数3601081259425741040001889

3 结论与讨论

三元杂种F1是由陆地棉、澳洲棉、黄褐棉3种棉种种间杂交而成，观察三元杂种的小孢子发育时期发现，出现了不同程度的微核和后期不同步分离，降低了远缘杂种的育性，因此，需要对F1进行强制自交或大量回交等方法使其恢复育性。目前已有这些方面的报道，如张伯静等[9]在亚洲棉、比克氏棉和陆地棉异源四倍体的研究时，先将亚洲棉和比克氏棉杂种染色体加倍，恢复其育性，再和陆地棉杂交，但得到的三元杂种F1不育，通过大量回交及组织培养后，培育出可育的杂种后代，又通过株系间修饰杂交最终得到稳定的种质系；高燕会等[10]利用强制自交使四元杂种的育性部分恢复；此外，吴玉香等[11]利用活体保存对栽培棉种间四元杂种育性和染色体构型的影响研究中证明，延长种间杂种植株的生长时间有利于协调不同来源的染色体组之间的关系，使染色体组趋于平衡，育性得到大幅度恢复。由于种间三元杂种是3个不同的棉种合成的，包含3个染色体组(A、D、C)，其中A、D染色体组和C染色体组的亲缘关系较远，其染色体同源性很低，因此花粉母细胞在减数分裂中期大多数染色体不能配对成二价体，未配对的单价体在减数分裂第一次分裂后期向两极随机分离，或丢失，或形成微核，最终导致不能形成正常的四分孢子，而形成多分孢子，导致花粉粒没有生活力，这是三元杂种不育的主要原因。

通过远缘杂交新获得的远缘杂种类型只是育种的基础材料，仍需再进行杂交、回交和选择，以恢复其育性，并保持和提高目标性状及主要经济性状的选择，选育出生产上能够利用的类型。

参 考 文 献

[1]Fryxell P A. A revised taxonomic interpretation ofGossypiumL.(Malvaceae)[J].Pheedea,1992, 2(2): 108-165.

[2]梁正兰. 棉花远缘杂交[M].北京:科学出版社,1999:1-2.

[3]庞朝友，杜雄明，马峙英.棉花种间杂交渐渗系创新效果评价及特异种质筛选[J].科学通报,2006,51(1):55-62.

[4]Valicek P.李贤柱,吴敬音,译.野生棉与栽培棉[M].北京:农业出版社,1978:39-40.

[5]Fryxell P A. A reviation of the Australian species ofGossypiumwith observations on the occurrence ofThespesiain Australia (Malvacea)[J].Aust J Bot,1965,13:71-102.

[6]Ndungo V,Demol J,Maréchal R.L'amélioration du cotonnierGossypiumhirsutumL. par hybridation interspécifique[J].Bull Rech Agron Gembloux,1988,23(1):27-49.

[7]Wendel J F,Cronn R C.Polyploidy and the evolutionary history of cotton[J].Adv Agron,2003,78:139-186.

[8]顾本康，李经仪，顾萍，等.棉属野生种枯萎病、黄奏病抗性鉴定初报[J].江苏农业科学,1993(5):36-37.

[9]张伯静，李炳林，祝水金，等.亚洲棉、比克氏棉和陆地棉异源四倍体的合成[J].棉花学报,1993,5(1):15-20.

[10]高燕会,祝水金,季道藩.四种栽培棉合成的四元杂种F1细胞遗传学研究[J].棉花学报,2003,15(5):259-263.

[11]吴玉香,陈崇乾,高燕会,等.活体保存对栽培棉种间四元杂种育性和染色体构型的影响[J].棉花学报,2007,19(6):461-466.