阿基瑞林的固相合成

高 杨，赵红玲，王小青，王良友，尹志峰

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

阿基瑞林的固相合成

高 杨，赵红玲，王小青，王良友，尹志峰

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

阿基瑞林;固相合成;Rink树脂

Argireline(阿基瑞林)，又名乙酰六胜肽-3，经现代生化机制科学合理设计，是模仿SNAP-25蛋白N端合成的由6个氨基酸组成的寡肽[1-2]。阿基瑞林具有抗皱活性，且经过临床试验，安全性可以保证，功效可与A型肉毒毒素媲美，但避免了肉毒毒素必须采用注射应用方式和使用成本高昂的缺点。阿基瑞林现已成为风靡世界的抗皱化妆品原料，许多高端化妆品均应用了阿基瑞林成分用于抗皱[3-4]。鉴于阿基瑞林市场需求量日益增加，目前鲜有固相合成方面的相关文献报道，且反应条件复杂[5]。本研究采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成法，以Rink Amide树脂为载体，通过逐步偶联氨基酸得到阿基瑞林，为其进一步固相合成条件的优化奠定了基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 AR224CN分析天平(美国奥豪斯仪器上海有限公司);制氮机(苏州华徳气体设备有限公司);TDL-40B高速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);SHZ-Ⅳ循环水多用真空泵(南京科尔仪器设备有限公司);Heal Force系列纯水机(香港力康公司);Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司);Agilent1200系列高效液相-ESI质谱联用仪(美国Agilent公司)。

1.2 主要材料 Rink Amide Resin树脂(天津南开合成科技有限公司);Fmoc-Arg(pdf)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(四川成都诚诺科技有限公司);Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑(HOBT)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(苏州中科天马肽工程中心有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(天津科密欧化学试剂有限公司);冰乙醚、二氯甲烷(天津博迪化工股份有限公司);三氟乙酸(天津市风船化学试剂科技有限公司);间甲苯酚、甲基苯基硫醚(上海晶纯试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 阿基瑞林的合成

2.1.1 溶胀脱Fmoc:把Rink Amide Resin树脂(替代度0.58mmol/g)1.729g(1mmol)投入到多肽反应柱中，10ml DMF洗涤一次，抽干;8ml DMF溶涨，N2吹拂搅拌30min至树脂充分泡涨，抽干液体;10ml DMF洗涤一次，抽干。加入6ml DBLK溶液(20%哌啶/DMF(V/V))，脱除Fmoc保护基7min，抽干，10ml DMF洗一次，再加入6ml DBLK溶液(20%哌啶/DMF(V/V))5min，全部脱除Fmoc保护基，使用茚三酮检测法茚检为蓝色，脱除Fmoc完成。分别加入DMF、DCM各5ml，洗涤树脂三次。

2.1.2 氨基酸偶联:称取Fmoc-Arg(pdf)-OH(4mmol)2.595g，DIC(4mmol)0.6ml和HOBt(4mmol)0.542g，5ml DMF溶解，加入到树脂中，N2吹拂搅拌反应2h，茚三酮检测法定性检测无色，抽滤去除反应液。10ml DMF洗涤一次，抽干。加入6ml 20%哌啶/DMF(V/V)溶液，脱除Fmoc保护基7min，抽干，10ml DMF洗一次，再加入6ml DBLK溶液(20%哌啶/DMF(V/V))5min全部脱除Fmoc保护基，茚检为蓝色，脱除Fmoc完成。分别加入DMF、DCM各5ml，洗涤树脂三次。按照以上方法氨基酸及缩合剂投料为4倍投料，从N端到C端循环偶联其余5个氨基酸Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH。

2.1.3 乙酰化、干燥:阿基瑞林末端为乙酰，加入封闭液(VAC2O/V吡啶=7:6)，乙酰化反应6h，茚检无色，分别用DMF洗涤树脂3次、二氯甲烷洗涤3次，每次洗涤1min左右，再用甲醇收缩3次，每次收缩7min，抽掉。在反应柱口塞上卷纸，真空干燥抽干至树脂呈流沙状。

2.2 肽链切割 配置10ml裂解液(三氟乙酸:甲基苯基硫醚:间甲酚=98:1.9:0.1)于50ml圆底烧瓶中，塞上玻璃塞，-20℃冰箱冷冻30min后拿出，放入搅拌子。将1g肽树脂缓缓加入到裂解液中，全部加完后计时。室温裂解2h(现象:原树脂和裂解液均呈浅黄色，混合后均呈深暗红色)。过滤，将滤出液体缓慢滴加入装有60ml乙醚的血清瓶中，3200r/ min离心，倒出上清液，用乙醚研洗粗肽，再次离心，上述两步循环操作4次。置空气中静置15min，刮取少量样品检测，其余转移至真空干燥器中，进行减压干燥。

2.3 结果检测 所得产品为白色粉末0.658g，并进行相关检测。

2.3.1 高效液相色谱(HPLC)检测:色谱柱为Agela C18柱(4.6×250mm，10μm);检测波长:214nm;流动相:缓冲 液A:0.1%TFA/H2O+，B:乙 腈;流 速:1ml/min;进样量:10μl;洗脱条件B项5%-95%，保留时间6.097min。HPLC纯度为64.5%。

2.3.2 质谱(MS)检测:扫描范围100-200，质谱检定结果为m/z(%):[M+H]+=889.1，[M+H]2+=445.0，与理论值相符。

3 讨论

从Rink Amide Resin树脂出发，先进行Fmoc-Arg(pdf)-OH偶联，合成Fmoc-Arg(pbf)-Rink Amide Resin按照氨基酸顺序从N端到C端循环偶联RQMEE，Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，末端乙酰化反应。裂解液选用(三氟乙酸:甲基苯基硫醚:间甲酚=98:1.9:0.1)经裂解、洗涤、沉降、离心得白色粉末，其结构经MS确认。本研究建立的阿基瑞林固相合成方法在常温下进行，氨基酸及缩合剂投料为4倍投料，反应时间2h，HPLC纯度为64.5%。本研究结果可为阿基瑞林的固相合成研究提供一种可行的方法。

[1]杜登学,王姗姗,周磊.肽类在化妆品中的应用[J].山东轻工业学院学报(自然科学版),2012,26(1):35-39.

[2]郭建维,钟星,徐晓健.药妆品胜肽的合成及作用机制研究进展[J].广东工业大学学报,2013,30(3):1-8.

[3]钟星,郭建维,成秋桂.胜肽在化妆品行业的应用和最新进展[J].日用化学品科学,2013,35(11):35-38.

[4]朱亮亮,绳则翠,陈英文.沈树宝含有困难氨基酸序列Arg-Arg的醋酸阿基瑞林的固相合成及其动力学研究[J].高校化学工程学报,2013,27(5):791-797.

[5]王立晖,袁永俊,李娅奇.生物活性多肽制备与纯化的研究进展[J].安徽农业科学,2012,40(14):8021-8023.

(技术方法栏目编辑:张 健)

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1004-6879(2014)05-0420-02

2014-03-12)