高效液相色谱法测定截短侧耳素的含量

张　婷，金　鑫，李　倩， 涂小进

(1.武汉软件工程职业学院，湖北 武汉430205；2.华中农业大学，湖北 武汉430070)

截短侧耳素(pleuromutilin)是高等真菌担子菌纲侧耳属Pleurotsmutilus和Pleurotspasseckerianus菌种经深层培养产生的一种抗生素，属双萜类化合物。已上市的截短侧耳素衍生物泰妙菌素(tiamulin)和沃尼妙林(valnemulin)被广泛用作兽药，2007年由英国葛兰素史克研发的另一种衍生物瑞他莫林(retapamulin)通过美国FDA和欧盟批准，是第一个人类使用的局部外用截短侧耳素类抗生素[1]。作为半合成起始原料的截短侧耳素将会有很好的市场。在截短侧耳素研制过程中，需要对其和杂质含量建立一种快速、准确的分析方法。鉴于此，作者采用HPLC法对截短侧耳素和杂质的含量进行分析测定。

1　实验

1.1　试剂与仪器

截短侧耳素供试品，湖北健源化工有限公司；截短侧耳素标准品，Sigma公司；乙腈，色谱纯；KH2PO4，分析纯。

Agilent1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技公司；UV-1801型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司。

1.2　方法

1.2.1标准品/供试品溶液的配制

1.2.2系统适应性溶液的配制

精密量取1 mL截短侧耳素标准品溶液，置于100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度。

1.2.3色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为CH3CN-0.02 mol·L-1KH2PO4缓冲溶液(50∶50，体积比)，流速1.0 mL·min-1，检测波长205 nm，进样量20 μL，柱温25 ℃。

2　结果与讨论

2.1　检测波长的选择

取截短侧耳素标准品适量，配制成浓度为20μg·mL-1的溶液，扫描紫外吸收光谱。结果发现，截短侧耳素在205 nm处有最大吸收，故选择检测波长为205 nm。

2.2　流动相的选择

1)实验发现，选用CH3CN-0.02 mol·L-1KH2PO4缓冲溶液作为流动相的分离效果与CH3CN-0.1 mol·L-1KH2PO4缓冲溶液作为流动相时的分离效果相当[2-3]。为满足实验分析方法要求，选择CH3CN-0.02 mol·L-1KH2PO4缓冲溶液作为流动相。

2)当用10 mol·L-1KOH溶液调节CH3CN-0.02 mol·L-1KH2PO4缓冲溶液pH值为7.0±0.2时，由于10 mol·L-1KOH溶液浓度高，黏度大，导致仪器系统压力波动大，分离效果与不调节pH值时没有明显区别。故本实验不需调节缓冲溶液pH值。

（1）刚性的规章制度起主要作用。在被问及学校的管理发展到哪个阶段时，64.67%的同学表示学校的管理现在处于第二阶段，主要依靠一套完善的管理制度和机制。只有 14%的同学表示学校的管理处在第三个阶段，主要依靠校园文化（此处的文化是指价值理念层面），这说明，目前该大学的管理中价值理念层面的文化起到一定的作用，但主要是依靠刚性的规章制度。

3)有机相可选用甲醇或乙腈，但由于截短侧耳素最大吸收波长较低，乙腈较甲醇吸收小，产生的噪声小，保留时间、分离效果也较好，故有机相选择乙腈。

4) 实验发现，梯度洗脱虽然缩短了检测时间，但是基线漂移，计算出的杂质含量不准确。故本实验采用等度洗脱。

2.3　适应性与精密度实验

取同一份系统适应性溶液，连续进样6次，所得色谱峰的峰面积RSD为0.30％,各峰之间的分离度均大于1.5；拖尾因子均小于2.0；理论塔板数均大于2 000[2]。表明方法的适应性与精密度良好。

2.4　专属性与重复性实验

取截短侧耳素标准品溶液和供试品溶液进样，截短侧耳素与各杂质峰之间的分离度均大于1.5。

取同一批截短侧耳素供试品溶液6份，每份进样1次，计算总杂质含量的RSD为1.3％，主成分含量的RSD为0.92％。表明方法的专属性与重复性良好。截短侧耳素供试品溶液的高效液相色谱见图1。

图1　截短侧耳素供试品溶液的高效液相色谱

2.5　检出限与定量限

取截短侧耳素标准品，配制成合适浓度，连续进样3次，记录峰高S，使信噪比S/N=3±1，测得检出限为2.24 ng；使S/N=10±1，测得定量限为6.84 ng。

2.6　线性范围

将截短侧耳素标准品配制成5种不同浓度(μg·mL-1)：0.12、400、1 200、2 000、2 400，每个浓度连续进样2次，取平均值。以峰面积(A)为纵坐标、标准品浓度(c)为横坐标，绘制标准曲线(图2)，拟合得线性回归方程为A=1.7559c+5.3832，R=0.9998。表明，截短侧耳素浓度在0.12～2 400 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

图2　截短侧耳素溶液的标准曲线

2.7　回收率实验

以截短侧耳素系统适应性溶液为本底，分别加入0.12 μg·mL-1、2 000 μg·mL-1、2 400 μg·mL-1的标准品溶液后进样检测，回收率在90％～110％范围内，平均回收率为98.7％，RSD为2.0％。

2.8　稳定性实验

将截短侧耳素标准品溶液分别放置1 d、2 d、3 d后进样检测，RSD均小于2.0％，理论塔板数、拖尾因子均符合要求，峰面积基本不变，表明该溶液在3 d内稳定。

2.9　样品测定

分别取3批截短侧耳素供试品溶液，配制成适当浓度，进样检测，按外标法计算含量分别为91.8％、91.4％和92.0％，RSD分别为0.35％、0.29％和0.32％。表明方法的准确性、专属性较好。

3　结论

建立了截短侧耳素含量的HPLC检测方法。结果表明，截短侧耳素浓度在0.12～2 400 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好(R=0.9998)，平均回收率为98.7％，检出限为2.24 ng，定量限为6.84 ng。该法简便、准确、专属性好，适用于截短侧耳素的含量测定[5]。

参考文献：

[1]金学平,吴旭乾,阮建兵,等.截短侧耳素制备方法的研究概况[J].中国医药科学，2012，2(9):69-70.

[2]邹祥.高效液相色谱法测定发酵液中截短侧耳素的含量[J].食品与发酵工业，2006,32(3):83-85.

[3]吴雪萍，孙凤霞，苏为科，等.截短侧耳素的HPLC测定[J].河北科技大学学报，2008,29(1):30-32.

[4]ICH Harmonised Tripartite Guideline：Validation of Analytical Procedures，Q2(R1)[S].

[5]吴春丽，覃春菀，张俊霞，等.菌渣中截短侧耳素含量的高效液相色谱法测定[J].郑州大学学报(医学版)，2009,44(1)：178-180.