人参须固态发酵中皂苷Rb2与Rb3的动态变化

闫梅霞，崔丽丽，许世泉，刘俊霞，王英平※

(1．中国农业科学院特产研究所，长春 130112； 2．吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101)

双向固态发酵又称新型固体发酵，是指具有活性成分的药性基质被药用真菌发酵，它既能提供真菌所需营养大量生长菌体，同时又能因真菌的酶而改变其原来的成分，发酵具有双向性，产品称为药性菌质[1]。人参是我国传统名贵中药，具有益气补虚、安神降压、益气生津之功效。现代药理研究证实，人参皂苷是发挥其药理作用的主要活性成分，人参皂苷Rb2、Rb3为原二醇型人参皂苷，对心肌缺血有保护作用[2]，二者组合物对大鼠急性心肌梗死有保护作用[3]，Rb3还具有降血糖，抗氧化等作用[4]。我国利用发酵法炮制中药的历史悠久，目前在用的片仔癀、六神曲[5]、半夏曲[6]等都是发酵中药，且均为多菌种发酵，中药通过发酵达到了减毒增效和增加新药效的目的。现代发酵技术的进步、药用菌深层发酵研究、中药药理研究的深入为发酵中药提供了研究基础，中药发酵研究越来越受到关注。添加中药有效成分的液态发酵[7]、以中药为添加物或底物的固态发酵[8]和复方中药的发酵[9]均证实药用菌能够对中药的药效成分进行转化。本研究对人参皂苷Rb2、Rb3在药用菌赤芝固态发酵过程中含量动态变化进行研究，分析双向固态发酵对人参药效成分的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株

赤芝[Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst]由中国农业科学院特产研究所质量评价实验室分离纯化保藏。

1.2 培养质

试管、平板菌种培养基(复合PDA配方)；液体菌种培养基(PDB配方)；固体发酵培养基(人参须切段，辅料为纯净水，料∶水1∶2，121℃灭菌25min，制作为人参须发酵基质)。

1.3 发酵工艺

试管菌种平板复壮后制作液体菌种，液体菌种180r/min 24℃暗培养3d，然后转接培养2级菌种，培养3d后接种于固体发酵基质，接种量10%。

1.4 发酵过程与样品测定

于整个发酵培养过程的1d、2d、4d、6d、8d、10d、13d、16d、20d、24d、28d、32d进行观察和取样，灭菌后的基质为空白对照。样品按1∶10(g/mL)加入甲醇，超声30min，连续3次。超高效液相色谱仪测定，Rb2检出限0.55、定量限为1.84；Rb3检出限1.41、定量限4.70。

1.5 仪器与试剂

MJX-100B-Z霉菌培养箱(上海博讯实业有限公司)；LDZX-75KBS灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；ACQUITY超高效液相色谱仪(Waters公司)；人参皂苷标准品Rb2和Rb3(四川维克奇生物科技有限公司)；其余试剂为分析纯。

2 结果与分析

2.1 菌丝生长状态分析

赤芝菌丝在人参须基质上生长，大约20d左右可以长满整个基质，然后随着培养时间的延长，大约30d左右观察到基质出现缺水现象。菌丝在基质上生长时未见气生菌丝旺盛的表现，也没有出现厚菌膜(图1)。

2.2 发酵过程中皂苷含量变化分析

赤芝双向固态发酵对2种人参皂苷有转化作用，发酵过程含量变化显著。Rb2在发酵初期1d～2d含量显著升高，2d～20d含量逐渐降低，20d时含量远低于对照，20d～24d含量显著升高，24d含量介于发酵4d～8d之间，24d～28d含量显著降低，28d～32d未检测出。Rb3在发酵0d～2d含量升高，1d～2d含量接近，2d～24d含量逐渐降低，24d～32d未检测出。整个发酵过程中2种皂苷含量的变化过程不相同，Rb2含量有2次升高过程，Rb3有1次升高过程；Rb2完全转化需28d，Rb3完全转化需24d。赤芝固体发酵不同时期可以获得皂苷含量不同的发酵基质(图2)。

2.3 菌丝生长与皂苷含量分析

结合图1和图2进行分析，在接种后0d～6d，2种皂苷含量出现先升高后降低的变化，说明从液体菌种到固体发酵培养菌丝过程中，在菌体酶系作用下，Rb2和Rb3含量变化显著；6d～20d菌丝逐渐长满基质，2种皂苷含量均逐渐减低，说明伴随菌丝长满基质皂苷含量降低。菌丝长满基质后，Rb3含量继续减少直到基质中检测不到；Rb2含量出现先升高后降低为0的过程，说明发酵后期随着菌体对基质的持续利用，不同皂苷含量变化相差较大。

3 讨论

利用真菌发酵对人参皂苷进行转化具有积极意义。刘洋选用黑根霉对红参水煎液进行液态发酵研究证实，发酵产物增强记忆活性显著高于红参水煎液。发酵产物的高效液相色谱检测证实，人参皂苷组分发生变化，稀有皂苷Rg3、Rg5等增加；王洪峰报道，人参固态发酵30d后总皂苷含量减少，但稀有皂苷Rg3、Rh1含量增加。本试验对赤芝、人参双向固态发酵进行了研究，证实赤芝固态发酵对人参皂苷Rb2和Rb3有转化作用，并且伴随发酵的进行，能够降低其在基质中的含量。

[1]庄毅.中药内的生物制药——固体发酵工程系列及其真菌药物[J].菌物研究,2013,11(2):63-71.

[2]刘玉莲.人参皂苷Rb组单体和Rd对心肌缺血干预作用及机制的研究[D].长春:吉林大学,2009.

[3]王友联,刘一鸣,孙伟伦,等.人参皂苷Rb3及Rb2组合物对大鼠实验性心肌梗死的保护作用[J].人参研究,2012,(2):2-5.

[4]孟凡丽,苏晓田,郑毅男.人参皂苷Rb3对糖尿病模型小鼠的降血糖和抗氧化作用[J].南京农业大学学报,2013,34(4):553-557.

[5]邹吉野,李莹,王德馨,等.六神曲的发酵菌种分离及纯种发酵考察[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(16):12-14.

[6]王世宇,任振丽,傅超美,等.半夏曲发酵处方的筛选[J].华西药学杂志,2009,24(4):367-369.

[7]刘洋.红参水煎液的液体发酵工艺优化及产物药理活性研究[D].长春:吉林农业大学,2012.

[8]王洪峰,邱智东,朱凯.人参双向固体发酵过程中化学成分的变化[J].吉林农业大学学报,2013,35(3):316-321.

[9]苏建树.双向固态发酵附桂骨痛复方化学成分的研究及HPLC指纹图谱的建立[D].北京:北京化工大学,2010.