Ecdysoneless在胃癌组织中的表达及其意义

张瑾，刘素霞，王倩

（1.丽水市中心医院 检验科，浙江 丽水 323000；2.丽水市人民医院 检验科，浙江 丽水 323000）

·论 著·

Ecdysoneless在胃癌组织中的表达及其意义

张瑾1，刘素霞1，王倩2

（1.丽水市中心医院 检验科，浙江 丽水 323000；2.丽水市人民医院 检验科，浙江 丽水 323000）

目的：探讨ecdysoneless（ECD）在胃癌中的表达及其与肿瘤病理参数和预后的关系。方法：Real-time PCR法检测56例胃癌组织及其对应癌旁正常胃黏膜组织中的ECD mRNA表达水平；免疫组化法检测100例胃癌组织中ECD蛋白的表达情况，分析ECD蛋白表达与胃癌病理参数及预后之间的相关性。结果：PCR结果显示ECD mRNA在胃癌组织中较癌旁正常胃黏膜组织中表达增高。100例胃癌组织中54例（占54.0%）ECD蛋白阳性表达。胃癌组织中ECD表达与肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、组织学类型无显著相关性（P＞0.05），而与Lauren分型、淋巴结转移、脉管侵犯、远处转移、TNM分期密切相关（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，ECD表达阳性组的平均生存时间为（35.8±1.9）月，显著低于阴性组的（45.2± 1.9）月（P＜0.01）；ECD表达阳性组的五年生存率为24.1%（13/54），低于阴性组的50.0%（23/46）（P＜0.01）。多因素Cox回归分析显示，TNM分期、Lauren分型可以作为胃癌的独立预后因子（P＜0.05），而ECD表达不能作为胃癌的一个独立预后因子（P=0.212）。结论：ECD在胃癌中表达增高，其表达水平与Lauren分型、淋巴结转移、脉管侵犯、远处转移、TNM分期密切相关，且其高表达与胃癌预后相关。

胃肿瘤；ecdysoneless；预后

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，是世界肿瘤第二大死亡原因[1]，其发生、发展受多基因调控[2]。近年来随着分子生物学发展，越来越多的蛋白质分子生物标记物应用于恶性肿瘤的预后判断。Ecdysoneless（ECD）是新近发现的一个细胞周期调节基因，与细胞增殖、分化，以及细胞周期进展具有密切关系。报道称ECD在胰腺癌和乳腺癌的癌组织中呈高表达，并预示不良预后[3-4]，但其在胃癌中的表达情况鲜有报道。本研究通过Real-time PCR法检测ECD mRNA在胃癌组织及癌旁非肿瘤组织中的表达情况，并用免疫组织化学（以下简称免疫组化）法检测ECD蛋白在胃癌组织中的表达情况，探讨其与胃癌病理参数及预后的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料收集丽水市中心医院2001-2004年胃癌患者100例石蜡样本，所有病例均经病理证实，且术前未经任何放、化疗。其中男60例，女40例，男女比例为3:2；平均年龄58.23岁（31～80岁）。所有病例随访5年以上，生存期的计算从手术日期到随访截止日期或由于复发、转移而死亡的日期为止。肿瘤组织根据美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）胃癌TNM分期标准（2010年第七版）进行病理分期，其他分型标准参见WHO分类（2000）胃癌部分。100例按分化程度分为高分化1例，中分化29例，低分化70例；按组织学类型分为乳头状腺癌5例，管状腺癌72例，黏液腺癌5例，印戒细胞癌18例；按淋巴转移分为无淋巴转移组32例，有淋巴转移组68例；TNM分期I期23例，I I期20例，I I I期38例，I V期19例。取胃镜正常黏膜组织做ECD免疫组化对照。

另外收集56份新鲜的胃癌组织及其配对的正常胃黏膜组织手术样本，其中男33例，女23例，年龄32～69岁，中位年龄为52岁。Real-time PCR法分析检测ECD mRNA在胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中的表达情况。所有病例均经病理证实，术前未经放、化疗，均经患者及家属知情同意。标本均于手术后立即取材，-86 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂ECD小鼠抗人单克隆抗体（sc-81860，Santa Cruz，美国）、Histostain-Plus kits LABSA Detection System免疫组化试剂盒（85-9043，Invitrogen，美国）和DAB显色液（Dako，美国）购自杭州言科生物技术有限公司。Trizol试剂、Reverse Transcription Systems反转录试剂盒（DRR047A）及SYBR荧光定量试剂盒（DRR420A）购自Takara公司。ECD及内参GAPDH基因PCR引物采用Primer5.0软件设计，由上海生工生物公司合成。

1.3 Real-time PCR检测ECD mRNA表达取约3 mg新鲜组织，液氮研磨，收集组织粉末，采用Trizol细胞裂解法提取组织样本总RNA，按说明书进行操作。利用核酸定量分析仪（ND-2000，美国Gene公司）检测总RNA纯度和浓度。按反转录试剂盒说明书采用随机引物法合成cDNA。用GAPDH作为内参照在Mx3000p荧光定量PCR仪上，利用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行荧光定量PCR反应。ECD引物序列：上游：5’-ACTTTGAAACACACGAACCTGGCG-3’，下游5’-TGATGCAGGTGTGTGCTAGTTCCT-3’；GAPDH引物序列：上游：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。PCR反应参数：94 ℃变性4 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；在延伸结束后进行荧光采集，进行40个循环，最后72 ℃维持10 min。采用2-△CT法分析各个样本中ECD相对于内参GAPDH的相对表达量。

1.4 免疫组化染色及结果判断标准常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，枸橼酸盐修复液高压修复3 min，3% H2O2孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，10%正常羊血清室温下封闭15 min，滴加小鼠抗人的ECD单克隆抗体（1:200稀释），4 ℃过夜，滴加生物素化标记的二抗，室温20 min，PBS洗涤3次后滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物，室温20 min。PBS洗涤3次后，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。同时，以PBS代替一抗作为阴性对照。

ECD蛋白表达情况根据染色强度和染色细胞百分率进行评定和分析，阳性细胞占计数细胞的百分率：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；染色强度：无色为0分，淡黄色，即弱阳性为1分，棕黄色，即中等染色强度为2分，棕褐色，即强阳性为3分；两者计分相乘即得出。最后得分：0为无表达，1～3为可疑表达，4～6为弱表达，7～12为强表达。最终统计分析时将0～3合并为阴性表达，4～12为阳性表达。结果的判断均采用统一评分标准和双盲法由两位经验丰富的病理医师来判读。

1.5 统计学处理方法所有数据均使用SPSS13.0软件进行分析，ECD mRNA在胃癌及其配对正常胃黏膜组织的相对表达量比较采用配对t检验；ECD蛋白阳性表达率与病理参数之间的相关性行x2检验；生存率分析采用Kaplan-Meier法并做Log-rank检验；多因素分析采用Cox比例风险回归模型。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ECD mRNA在胃癌组织和正常胃黏膜中的表达

检测结果显示，肿瘤组织中的ECD mRNA相对表达量为0.47±0.050，明显高于正常胃黏膜组织的0.27±0.030，差异具有统计学意义（t=3.761，P=0.0004）。详见图1。

2.2 胃癌中ECD蛋白的表达与临床病理参数及预后的关系免疫组化染色结果显示ECD在肿瘤细胞的细胞核及细胞浆中均有表达，而正常胃黏膜组织中除少量炎症细胞有表达外，胃黏膜细胞ECD均表达阴性（见图2）。

图1 胃癌及正常胃黏膜组织中ECD mRNA的相对表达量

图2 ECD在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达

胃癌组织中ECD的阳性率为54.0%（54/100）。胃癌组织中ECD表达与肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、组织类型无显著相关性（P＞0.05），而与Lauren分型、淋巴结转移、脉管侵犯、远处转移、TNM分期密切相关（见表1）。Cox多元回归分析结果显示TNM分期、Lauren分型可以作为胃癌独立预后的因子（P＜0.05），而ECD表达不能作为胃癌的一个独立预后因子（P=0.212）（见表2）。

2.3 ECD蛋白表达与胃癌预后的关系进一步进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示ECD蛋白表达阳性组的平均生存时间为（35.8±1.9）月，显著低于阴性组的（45.2±1.9）月（P＜0.01）；ECD蛋白表达阳性组的五年生存率为24.1%（13/54），低于阴性组的50.0%（23/46）（P＜0.01）。生存曲线见图3。

3 讨论

ECD基因最初是从果蝇的无退化蛋白（ecdysoneless）突变体内发现的，这种突变导致果蝇胚胎中蜕皮激素水平下降，从而使果蝇胚胎发育停滞于第二个幼虫龄期阶段[5]。虽然ECD基因发现已经近40年了，但是ECD基因所落在基因区编码的蛋白分子产物直到最近几年才被证实，这种基因突变产物可以导致除生殖和发育缺陷之外的一些细胞生存缺陷，不过促成这些生存缺陷的生物化学机制尚不明确[6]。Sato等[7]和Kainou等[8]研究发现ECD基因在酵母中可能与糖酵解相关基因的转录有关，是Schizosaccharomyces pombe（粟酒裂殖酵母）生长和生存的必需基因，但是它的功能及作用机制仍不清楚。Kim等[9]在对小鼠胚胎成纤维细胞的研究中发现，ECD能够与E2F竞争性地和磷酸化的Rb相结合，因此敲除ECD表达可能通过Rb-E2F通路，使小鼠胚胎成纤维细胞发生增殖停滞和G1-S细胞周期阻滞。Zhang等[10]等研究发现ECD基因表达能够与P53基因相互作用并且使其表达稳定，上调ECD表达能够增强P53相关靶基因的转录水平，因此他们提出ECD影响细胞生存和增殖可能与P53通路有关。研究发现ECD在正常胰腺组织中不表达，但是在胰腺癌及远处转移组织中呈现出高表达状态；体外细胞及裸鼠体内实验显示，下调ECD表达能够显著抑制胰腺癌细胞增殖及体外成瘤能力；基因芯片分析结果显示，ECD可能通过调节葡萄糖代谢相关基因GLUT4，影响肿瘤细胞糖分摄取，从而起到影响肿瘤细胞增殖的作用[11]。Zhao等[12]对104例乳腺导管腺癌和954例乳腺癌进行免疫组化实验发现，ECD在乳腺癌中表达增高，其表达与肿瘤分期、分化程度以及增殖有关，生存分析显示ECD高表达预后较差，且与HER2表达相关，可以作为乳腺癌的一个预后评判指标。以上研究显示ECD表达与肿瘤进展可能存在一定关系，但是其具体作用分子机制研究仍处于起步阶段。

表1 ECD表达与病理参数之间的关系

表2 Cox多因素回归分析结果

图3 生存曲线分析

本实验通过Real-time PCR分析发现相对于正常胃黏膜组织，胃癌组织中ECD的表达增高。免疫组化结果显示ECD在胃癌组织中阳性表达率为54.0%，进一步统计分析结果显示其表达水平与Lauren分型、淋巴结转移、脉管侵犯、远处转移以及TNM分期有关。生存分析结果显示，ECD蛋白表达阳性组患者的平均生存时间显著低于阴性组，且ECD蛋白表达阳性组的五年生存率显著低于阴性组。以上结果提示ECD高表达与胃癌预后相关。

综上所述，ECD蛋白的表达增高可能在胃癌发生发展中发挥重要作用，与其促进胃癌进展及转移有一定的关系。进一步深入研究ECD蛋白及其编码基因与胃癌的关系，对揭示胃癌的浸润、转移机制和探寻更为有效的治疗手段具有重要意义。

[1]Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

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[3]Zhao X, Mirza S, Alshareeda A, et al. Overexpression of a ovel cell cycle regulator ecdysoneless in breast cancer: a marker of poor prognosis in HER2/neu-overexpressing breast cancer patients[J]. Breast Cancer Res Treat, 2012, 134(1): 171-180.

[4]Dey P, Rachagani S, Chakraborty S, et al. Overexpression of ecdysoneless in pancreatic cancer and its role in oncogenesis by regulating glycolysis[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(22): 6188-6198.

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[10]Zhang Y, Chen J, Gurumurthy CB, et al. The human orthologue of drosophila ecdysoneless protein interacts with p53 and regulates its function[J]. Cancer Res, 2006, 66(14): 7167-7175.

[11]Dey P, Rachagani S, Chakraborty S, et al. Overexpression of ecdysoneless in pancreatic cancer and its role in oncogenesis by regulating glycolysis[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(22): 6188-6198.

[12]Zhao X, Mirza S, Alshareeda A, et al. Overexpression of a novel cell cycle regulator ecdysoneless in breast cancer: a marker of poor prognosis in HER2/neu overexpressing breast cancer patients[J]. Breast Cancer Res Treat, 2012, 134(1): 171-180.

（本文编辑：丁敏娇）

Expression and significance of ecdysoneless in gastric cancer

ZHANG Jin1, LIU Suxia1, WANG Qian2.

1.Department of Medical Laboratory, Lishui Central Hospital, Lishui, 323000; 2.Department of Medical Laboratory, Lishui People's Hospital, Lishui, 323000

Objective: To probe the ecdysoneless (ECD) expression and its correlation with clinical variables, such as clinical pathologic factors and prognosis in gastric cancer.Methods:ECD mRNA expression level in gastric cancer samples and matched normal gastric tissue from 56 patients was detected using Real-time PCR method. Immunohistochemical method was adopted to deteced the protein expression level of ECD in gastric cancer tiusse which with 5 years follow up.Results:ECD expression was up-regulated in gastric cancer tiusse compared with matched normal gastric tissue. Positive ECD immunoreactivity was seen in 54.0% of gastric cancer specimens, which was correlated with Lauren typing, lymph node metastasis, vessel invasion, distant metastasis, and TNM stage (P<0.05). Compared with ECD negative patients, ECD positive patients had significantly shorter survival times (35.8±1.9 month vs 45.2±1.9 month, P<0.01) and short survival rate (24.1% vs 50.0%, P <0.01). Multiariable COX regression analysis indicated that Lauren typing and TNM stage could serve as a dependent prognsis factor of gastric cancer (P<0.01), except ECD expression (P=0.212).Conclusion:ECD expression is increased in gastric cancer tissue. The ECD expression correlates with Lauren typing, lymph node metastasis, vessel invasion, distant metastasis, and TNM stage and poor survival rate in gastric cancer.

stomach neoplasms; ecdysoneless; prognosis

R735.2

A

1000-2138（2014）02-0117-05

2013-04-23

张瑾（1982-），女，浙江丽水人，检验师。