小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备及心肌梗死面积评价方法学比较

孟增慧 杨承志 田爱炬 吕志珍 张幼怡 高炜 李子健 郭丽君

.基础研究.

小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备及心肌梗死面积评价方法学比较

孟增慧 杨承志 田爱炬 吕志珍 张幼怡 高炜 李子健 郭丽君

目的 对小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备及心肌梗死面积评价方法进行比较。方法 40只雄性BAB/c小鼠按完全随机设计方法分为传统方法组和改良方法组，传统方法组的心肌再灌注操作采用再次开胸、松开结扎线的方法，改良方法组的心肌再灌注操作为在体外松开结扎线，无需再次开胸。采用伊文思蓝-TTC双染色方法区分缺血再灌注损伤后心肌的梗死区(IA)、缺血危险区(AAR)和左心室总面积(LV)。同时采用传统算法和质量权重法计算心肌梗死面积，质量权重法即在传统算法的基础上，用切片中各区域面积乘以该片心肌质量的百分比，累加各切片的相应区域面积，再计算百分比。结果 无论采用哪种算法，传统方法组与改良方法组心肌梗死面积(IA/AAR)差异无统计学意义(传统算法:传统方法组44.43%±2.28%，改良方法组44.24%±1.68%，P=0.96；质量权重法:传统方法组51.74%±2.26%，改良方法组54.51%±1.14%，P=0.23)。与传统方法组相比，改良方法组术后存活率高、麻醉剂使用剂量小、苏醒时间短(均为P＜0.05)。此外，采用质量权重法计算AAR/LV、IA/AAR数据的标准差显著小于传统算法(AAR/LV:传统算法标准差2.90，质量权重法标准差1.24；IA/AAR:传统算法标准差2.22，质量权重法标准差:1.00)。结论 与传统方法相比，改良方法能够更加稳定、有效地制备小鼠心肌缺血再灌注模型。此外，采用质量权重法计算的心肌梗死面积数据比传统方法准确性更高。

心肌缺血； 再灌注损伤； 小鼠； 模型，动物； 心肌梗死面积

冠心病已成为危害我国居民健康的头号杀手，2011年我国急性心肌梗死患者住院总费用高达49.9亿元［1］。药物溶栓、介入治疗和冠状动脉旁路移植术等是安全有效和广泛应用的再灌注方法［2］。然而，这些再灌注的策略在某些情况下也能导致进一步的心肌损伤，被定义为缺血再灌注损伤，发生率高达25%～30%，其机制尚未完全阐明［3］。因此，建立稳定有效的心肌缺血再灌注模型，有助于探索新的治疗靶点和防治方法。

小鼠是转基因动物的最广泛载体，且成本低、便于饲养繁殖，是制备心肌缺血再灌注模型的理想动物，但其耐创伤能力差、气胸发生率高，导致模型制作难度大、成功率低［4］。目前，国内外文献对再灌注这一步骤主要采用再次开胸、开放结扎线的方法［5］，但该方法对麻醉深度要求高，也增加了肺损伤致死的风险。此外，多数文献对于再灌注后心肌梗死面积的计算方法表述不详，所使用的评价计算方法也并不统一。本研究针对以上问题，探讨通过对心肌缺血再灌注模型的制备方法(尤其是再灌注步骤的方法)进行改良能否达到简化操作和提高模型成功率的目的，并对再灌注后心肌梗死面积的计算方法进行比较，旨在发现更规范、准确的心肌梗死面积的评价方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性8周龄BAB/c小鼠40只，体质量(28.50±0.16)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在北京大学医学部实验动物中心SPF级环境(室温23℃、相对湿度为65%，12 h明暗交替)饲养至12周开始实验，采用完全随机设计方法分为传统方法和改良方法两组，每组各20只。

1.2 主要试剂及仪器

1%戊巴比妥钠溶液，阿托品，小动物呼吸机(Kent scientific，TOPO)，小动物心电图检测仪(Softron，SP2006)，体式显微镜(Olympus，SZX16)，伊文思蓝(Evans blue，sigma)，1%氯化三苯基四氮唑(TTC，sigma)。

1.3 手术方法

1.3.1 麻醉及术前准备 小鼠术前禁食水8 h。称体重后，使用1%戊巴比妥钠溶液(0.60 m l/100 g)腹腔注射进行麻醉，如术中麻醉深度不足，则补充起始麻醉剂量的一半。小鼠麻醉后左侧胸部脱毛，经口腔气管插管后，连接小动物呼吸机维持呼吸，气道压力峰值14.40 cmH2O，呼吸频率88次/min，通气量1 L/min，观察到小鼠呼吸起伏与呼吸机频率一致。将小鼠仰卧，四肢固定于循环加热手术台上，连接小动物心电图检测仪肢导电极，记录术中心电变化。

1.3.2 缺血再灌注模型手术操作 手术区域备皮消毒，于胸骨左侧第3、4肋间剪开皮肤，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，打开胸腔，用开胸器撑开肋间、充分暴露心脏，剪开心包，在体视显微镜下仔细辨认，可见在心耳下缘或左侧出现一条粉红色血管即为左冠状动脉的前降支(LAD)。采用带线6-0线缝合针于心耳下缘1 mm处穿过心肌表层，待加压结扎LAD。传统方法组:结扎前在线下垫0.2～0.3 cm的10号聚乙烯管［6］，结扎LAD后看到左心室前壁心肌变白，局部收缩运动受限，左心耳充盈胀满，心电图见ST段持续弓背抬高，表明心肌缺血成功［7］。简易缝合关闭胸腔，缺血30 min后再次打开胸腔，取出聚乙烯管，剪开结扎线，可见心脏表面由苍白变为红色，心电图ST段抬高部分回落，判断再灌注成功［7］。待小鼠苏醒后，拔除气管插管，将其置于38℃保温毯上过夜。改良方法组:用两条长约5 cm的缝线线圈代替传统的10号聚乙烯管(图1A)，随后结扎LAD，确认心肌缺血后逐层关闭胸腔、缝合皮肤和肌肉，注意将两条线圈置于切口两侧并留在体外。缺血30 min后，双手同时缓慢用力，向小鼠身体两侧水平拉动线圈(图1B)，直至将其完全拉出体外，多数情况下可见一侧线圈上黏附心脏结扎线，此时心脏上的结扎线被线圈拉开，心电图ST段抬高部分回落，判断再灌注成功。待小鼠苏醒后，拔除气管插管，将其置于38℃保温毯上过夜。

图1 小鼠心肌缺血再灌注模型制备方法

1.4 心肌梗死面积评价

1.4.1 伊文思蓝-TTC染色 再灌注24 h后，再次麻醉小鼠、气管插管、连接呼吸机、打开胸腔，在缺血时结扎冠状动脉的位置再次结扎，用1 ml注射器插入心尖，注射1%伊文思蓝0.3 m l，将非缺血区心肌呈蓝色，其余心肌即为缺血危险区。立即摘取心脏，以预冷的PBS缓冲液冲洗残血，切除结扎线以上的心脏部分，用滤纸蘸干并放置于-20℃冰冻30 min，取出后迅速沿垂直左心室长轴的方向横切5～6片厚约1 mm的心肌，按顺序浸泡于预先37℃温浴的1%TTC溶液中，并放于37℃温箱中避光孵育10 min。此时梗死区被染成灰白色。

1.4.2 心肌梗死面积的计算 将染好的心肌切片放在EPSON扫描仪(V700)上，采用24位真彩，2400 dpi分辨率进行扫描。传统算法:采用Image-Pro Plus 6.0进行面积统计分析，分别计算左心室面积(全部心肌，LV)、缺血危险区面积(红色+白色，AAR)和梗死区面积(白色，IA)。质量权重法:将心肌切片逐一称质量，计算每片心肌切片质量占全部心肌切片质量的百分比，在传统算法操作的基础上，用各切片中各区域的面积乘以该片心肌质量的百分比。用AAR/LV评价结扎的位置是否一致，即经历缺血的缺血危险区是否相同，用IA/AAR评价心肌梗死的面积。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 模型存活率比较

传统方法组:再次开胸时，因气胸死亡1只，肺损伤死亡2只，麻醉深度不足再次补给麻醉剂后不耐受死亡2只，再灌后心律失常死亡1只，存活14只，存活率为70%。改良方法组:再灌后心律失常死亡1只，存活19只，存活率为95%(χ2=4.329，P=0.037)。

2.2 两种模型制备方法小鼠体质量、麻醉剂剂量及苏醒时间比较

传统方法组与改良方法组小鼠体质量差异无统计学意义［(28.30±0.22)g比(28.53±0.22)g，P=0.47］。传统方法组的平均麻醉剂(起始+补充)用量［(0.23±0.01)m l比(0.17±0.01)m l，P= 0.001］和平均苏醒时间［(185.50±7.35)min比(129.30±9.12)min，P=0.001］均大于改良方法组。

2.3 两种模型制备方法心肌缺血和再灌注时心电图变化的比较

传统方法组心电图(图2A)与改良方法组心电图(图2B)均出现缺血期ST段抬高、再灌注期ST段回落，提示缺血再灌注手术模型成功。

图2 小鼠缺血再灌注手术前、缺血、再灌期心电图

2.4 两种模型制备方法心肌梗死面积的比较

如图3A所示，伊文思蓝-TTC染色将非缺血区染成蓝色，缺血非梗死区染成红色，心肌梗死区染成白色。用AAR/LV评价缺血区面积(即结扎高度)，用IA/AAR评价心肌梗死的面积。无论采用传统算法(图3B)还是质量权重法(图3C)，传统方法组与改良方法组之间AAR/LV、IA/AAR差异均无统计学意义。以上结果表明改良后的再灌注方法同样可以保证造模成功。

图3 小鼠心肌组织伊文思蓝-TTC染色及心肌梗死面积计算

2.5 心肌梗死面积的计算方法比较

将传统方法组与改良方法组共34份心脏切片分别使用传统算法及质量权重法计算心肌梗死面积。结果显示两种计算方法所得数据AAR/LV(传统算法:56.04%±2.90%比质量权重法:62.68%± 1.24%，P=0.014)和IA/AAR(传统算法: 47.68%±2.22%比质量权重法:54.34%±1.00%，P=0.011)差异均有统计学意义，且质量权重法计算的数据标准差均低于传统算法(图4)。以上结果表明，不同的计算方法获得的实验数据存在统计学差异，且质量权重法的数据标准差更小，因此所获得的数据准确性更高。

图4 不同算法对心肌梗死面积评价的影响

3 讨论

近年来，药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术等再灌注疗法已成为临床上治疗心肌梗死的主要手段［8］，而由此造成的心肌缺血再灌注损伤现象也越来越受到重视，其发病机制及防治手段已成为亟待解决的研究热点。心肌缺血再灌注模型的建立，有助于研究疾病发病机制、病理变化、分子信号通路及药物疗效等。我们对制作难度大、成功率低的小鼠心肌缺血再灌注模型制作方法进行改良，提出了一种更简便、易操作的再灌注操作技术，并用质量的权重对心肌梗死面积评价方法进行校正，以便更加准确、客观的评价心肌梗死面积。

从模型存活率来看，传统的再灌注方法模型制备存活率较低(70%)，术中死亡5只，其中4只于再灌注操作时死亡，这与传统方法手术中需两次开胸、关胸造成的损伤有关，小鼠胸壁组织薄弱、耐创伤能力低、气胸发生率高，多次缝扎胸壁必然造成对胸壁及肺的额外损伤，降低手术存活率。改良方法中避免了二次开胸操作，模型存活率高达95%，仅有1只因再灌注后心律失常死亡，表明仅需1次关胸的线圈提拉法制作再灌注模型对小鼠造成的损伤更小，存活率更高。此外，相比于需要在麻醉状态下进行再灌注的传统方法(即麻醉状态下开胸移除结扎线)，改良的再灌注方法可在小鼠清醒的状态下进行操作，降低了小鼠的麻醉时间和麻醉药物剂量，因此也降低了小鼠对麻醉剂不耐受的概率，所以对于更长的缺血时间方案，改良的再灌注方法更具优势。由于改良的再灌注方法操作简便、快捷，可保证在极短的时间内完成再灌注，相比于传统的操作方法，改良方法对于再灌注开始的时间控制更为精确，更有效地确保了实验的严谨性和准确性。同时，无论是从心电图结果还是经心肌梗死面积评定都证实缺血再灌注模型制备成功，传统与改良的线圈提拉法制备的模型之间在缺血危险区和梗死区面积方面并不存在差异，使我们相信简便快捷的线圈提拉法小鼠心肌缺血再灌注模型制备技术有望替代先前广泛应用的传统方法。

伊文思蓝-TTC染色作为公认的评价心肌梗死面积的“金指标”，广泛应用于几乎所有涉及心肌梗死再灌注手术的实验中［9-11］，因此，建立一种准确、规范的计算心肌缺血梗死面积的方法具有重要的实际应用意义。从评价心肌梗死面积的方法来看，由于每片心肌切片质量相差较大，所以按照传统的忽略质量权重的计算方法来评价心肌梗死面积，显然与实际的心肌梗死面积有较大差异，欠缺规范性和准确性。从统计学数据上来看，将传统算法与质量权重法的心肌梗死面积进行比较，其差异具有统计学意义，且质量权重法计算所得数据的标准差更小。标准差越小，表明观察值间的变异性和离散程度低，均数的代表性好，数据的准确程度高。因此，质量权重法计算获得的数值离散程度更低，变异性小，数据准确性更高，有利于建立更规范、准确的心肌梗死面积的评价方法。

此外，在手术中还有以下几点应予以注意，以提高心肌缺血再灌注手术的成功率:(1)阿托品的使用:麻醉剂中应加入阿托品(1 ml/20 ml)，以减少支气管黏液分泌，降低气管插管被堵塞的风险；(2)体式显微镜的应用:在体式显微镜下可清楚观察到冠状动脉的走形，以确保准确、有效的结扎冠状动脉左前降支、控制心肌梗死面积，避免因解剖结构变异造成的实验误差；(3)术后处理:小鼠从麻醉中苏醒后易发生低体温，应置于保温毯上保温以降低死亡率，且有文献报道，小鼠体核温度可以影响心肌缺血损伤［12］，此外，由于小鼠术前禁水8 h，术中尚有额外的血液损失，容易造成小鼠低血容量，因此应注意给予充足水源，术中失血量过大者可酌情给予皮下注射生理盐水0.2～0.3 ml以维持循环血量。

综上所述，本研究结果提示，改良的线圈提拉法可能是一种更简便易行的小鼠心肌缺血再灌注模型制备手术的替代方法；心肌梗死面积计算方法的不同，可能会导致实验结果的差异，质量权重梗死面积计算法获得的数据准确性更高，但该算法对心肌梗死面积评价的优势尚需进一步验证。

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Com parison of methods for establishing mouse m yocardial ischem ia/reperfusion model and assessing myocardial infarct size

Meng Zenghui，Yang Chengzhi，Tian Aiju，Lyu Zhizhen，Zhang Youyi，Gao Wei，Li Zijian，Guo Lijun.
Department of Cardiology，Peking University Third Hospital，Institute of Vascular Medicine，Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides，Ministry of Health，Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Sciences，Ministry of Education and Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research，Beijing 100191，China

Objective The study aims to establish an efficient mouse model of myocardial ischemia/reperfusion and the assessment of myocardial infarct size.M ethods Forty male BAB/c mice were equally divided into the classic method group and the new method group.In the classic method group，reperfusion was achieved by reopening the chest and releasing the ligation，while in the new method group reperfusion was achieved by releasing the slipknot without opening the chest for the second time.Infarct area (IA)，area at risk(AAR)and left ventricular(LV)area was quantitatively evaluated by Evans blue-TTC staining.Two measurements were applied to analyze the data.Compared to the classic measurement，IA，AAR and LV areas on each section were multiplied by the percentage of weight of the section and then totaled from all sections in new measurement.Results The myocardial infarction size(IA/AAR)was not significantly different between classic and new method group(classic measurement:classic method group44.43%±2.28%new method group 44.24%±1.68%，P=0.96；new measurement:classic method group 51.74%±2.26%new method group 54.51%±1.14%，P=0.23).Higher survival rate，less anesthetic dosage and reduced analepsia time were observed in the new method group in comparison with the classic method group(all P＜0.05).In addition，the standard deviation of both AAR/LV and IA/AAR were lower in the new measurement group.Conclusions The new method for establishing myocardial ischemia/ reperfusion mouse model is more efficient compared with the classic method.Furthermore the new measurement is more accurate for the assessment of myocardial infarct size than the classic measurement.

Myocardial ischemia； Reperfusion injury； Mice； Models，animal； Infarct size

Guo Lijun，Email:guo_li_jun@sohu.com

2014-02-21)

(本文编辑:谭潇)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.02.012

100191北京大学第三医院心内科，血管医学研究所，卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室，分子心血管学教育部重点实验室，心血管受体研究北京市重点实验室

郭丽君，电子信箱:guo_li_jun@sohu.com