芎芍胶囊对动脉粥样硬化兔小凹蛋白-1及亲环素A的影响

张艳虹 徐凤芹

.基础研究.

芎芍胶囊对动脉粥样硬化兔小凹蛋白-1及亲环素A的影响

张艳虹 徐凤芹

目的 研究芎芍胶囊对动脉粥样硬化兔胆固醇逆转运关键蛋白小凹蛋白-1(cav-1)及亲环素A的影响，探讨其通过促进胆固醇逆转运抗动脉粥样硬化的可能机制。方法 60只新西兰兔按随机数表法分为空白对照组、模型组、芎芍小、中、大剂量组、辛伐他汀组。采用单纯高脂喂养法复制兔动脉粥样硬化模型。造模、给药15周后取胸主动脉，HE染色观察各组动脉斑块形成，蛋白印迹法(WB)测定主动脉壁内cav-1及亲环素A表达量，实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)测定主动脉壁内cav-1及亲环素A mRNA表达量，观察实验药物对胆固醇逆向转运相关蛋白的影响。结果高脂喂养15周后，模型组和给药组兔胸主动脉管壁上粥样斑块形成明显，各给药组较模型组有不同程度的改善。WB结果显示，与对照组相比，模型组cav-1表达量明显下降(P＜0.01)；芎芍中剂量及大剂量组较模型组表达量明显增加(均为P＜0.05)。模型组与对照组相比亲环素A表达明显增多(P=0.01)；除芎芍小剂量组外，各治疗组较模型组亲环素A表达均有减少(均为P＜0.05)。实时定量PCR结果显示，与对照组相比，模型组cav-1 mRNA表达量明显减少(P＜0.01)；芎芍大剂量组及辛伐他汀组较模型组其表达量明显增加(均为P＜0.05)。模型组较对照组亲环素A mRNA表达量少，但无统计学意义(P＞0.05)；芎芍大剂量组及辛伐他汀组较模型组与对照组表达量明显升高(均为P＜0.01)。结论 芎芍胶囊能适度调节cav-1及亲环素A的表达，其抗动脉粥样硬化的机制可能涉及促血管平滑肌细胞的胆固醇逆转运过程。

动脉粥样硬化； 小凹蛋白-1； 亲环素A； 芎芍胶囊

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多因素相关的复杂病理过程，近年来，关于胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)的研究成为抗AS治疗新热点。胆固醇借助高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及载脂蛋白A-I(apo-AI)从富脂细胞中流出转运至肝脏代谢后经胆汁或其他途径排出体外［1］即RCT，其中胆固醇在富脂细胞中的跨膜转运是RCT启动关键，小凹蛋白-1(caveolin-1，cav-1)及亲环素A是将细胞内胆固醇转运至胞膜的重要蛋白［2-3］。前期实验已证明芎芍胶囊抗AS效果确切［4-6］，本研究旨在观察芎芍胶囊对AS兔胸主动脉管壁cav-1及亲环素A表达水平的影响，探讨其抗AS的新机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 纯种健康新西兰大耳白兔60只，雄性，8～10周龄，质量1.90～2.70 kg，平均(2.275±0.155)kg，中国医学科学院实验动物研究所提供，单笼饲养，9 d适应性喂养后进行实验。

1.1.2 实验药物及特殊饲料 芎芍胶囊由中国中医科学院西苑医院药剂科提供，每克颗粒粉含生药川芎2 g，赤芍1 g；辛伐他汀片(商品名:舒降之，生产厂家:杭州默沙东，批号:120544)，20 mg/片；高脂饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司生产，配方:1%胆固醇+15%蛋黄粉+5%猪油+79%基础饲料(前3周蛋黄粉为7.5%，另加0.5%胆酸盐促进胆固醇吸收)。

1.1.3 主要实验仪器及试剂 定量PCR仪(StepOne PLUS Applied Biosystems)，凝胶成像系统(JY04S-3C，北京君意东方电泳设备有限公司)。Caveolin-1 antibody(abcam，ab86711)，cyclophilin-A antibody(abcam，ab3563)HRP标记的羊抗兔IgG抗体(博士德，BA1054)，SGTriEx高纯总RNA提取试剂盒(#55-11120 SinoGene)，Thermo First cDNA Synthesis Kit(#33-10201，SinoGene)，2×SG PCR MasterMix(#33-10201，SinoGene)，2×SG Green qPCR Mix(with ROX)(#22-10102，SinoGene)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备与分组给药方法 参照国内外相关文献报道配比高脂饲料［7-8］，采用单纯高脂喂养法建立兔AS模型。新西兰兔60只，按随机数表法随机分为6组，每组10只。空白对照组予普通饲料150 g/d；模型组予高脂饲料150 g/d；各给药组按临床药理实验种间换算公式计算每日给药量，每日给予高脂饲料150 g及相应含药饲料。含药饲料由相应药物混入普通饲料制成，各组每日给药量如下:芎芍小剂量组给予川芎0.6 g/kg，赤芍0.3 g/kg；芎芍中剂量组及大剂量组以2倍剂量递增；辛伐他汀组给予辛伐他汀1 mg/kg。保证模型组与各给药组每日摄入相同数量的高脂饲料，连续喂养15周。

1.2.2 观察项目及检测方法 (1)取材:第15周末予3%戊巴比妥钠1 m l/kg耳缘静脉注射麻醉后，空气栓塞处死。取出主动脉至腹主动脉分叉处上端。生理盐水冲洗后，从中间剖开置于预冷培养皿上按顺序分装，一部分置于中性甲醛液中固定后HE染色；一部分经液氮速冻后，用于WB及实时定量PCR检测。(2)染色:固定于中性甲醛液中的样本，石蜡包埋后切片行HE染色观察血管结构及斑块形成。(3)WB检测cav-1/亲环素A蛋白表达:将兔主动脉组织加裂解液匀浆，离心去除沉淀，使用BCA试剂测定样品蛋白含量，调整上样缓冲液量使各组上样蛋白量一致，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶90 V恒压电泳3 h，转移至PDVF膜上，TBST洗膜后加入封闭液，封闭1 h，洗膜，按1∶200加入cav-1/亲环素A一抗，室温孵育2 h，洗膜后加入稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，室温孵育1 h，重复洗膜，采用化学发光试剂盒，结果以X光片显示。扫描仪收集图像，并使用Quantity One分析目标条带及内参蛋白β-actin灰度值，做初步定量统计。(4)实时定量PCR反应测定cav-1 mRNA/亲环素A mRNA表达:应用试剂盒提取细胞总RNA，经DNaseI处理后配置逆转录PCR体系，电泳检测无扩增产物后进行反转录，使用Thermo First cDNA Synthesis Kit进行逆转录合成cDNA，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参对照，进行实时定量PCR反应。cav-1上游引物为5'-ACACCAAGGAAATCG-ACCTG-3'，下游引物5'-TCCCTTCTGGTTCTGCAATC-3'，亲环素A上游引物为5'-ACAGGTCCTGGCATCTTGTC-3'，下游引物5'-GCTCATGCCCTCTTTCACTC-3'，电泳检测后初步鉴定。采用SYBR GREENI荧光染料法行real-time PCR，配置反应体系后混匀离心，移至96孔PCR板，每个样本做3个平行反应，取平均值。根据扩增曲线，设置空白对照组表达量为1，采用2-ΔΔCt计算各组cav-1 mRNA及亲环素A mRNA相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组兔AS病理比较

空白对照组平滑肌细胞排列整齐紧密有序，内皮细胞层连续，内皮下未见脂质沉积；模型组内皮层脱落，管壁内满布斑块，内膜增生严重，可见大量泡沫细胞，中外膜不规则增厚，泡沫细胞浸润；芎芍小剂量组见明显斑块，但厚度较模型组变薄，中外膜增厚，未见典型泡沫细胞浸润；芎芍中剂量组见内皮细胞尚连续，斑块厚度明显减小，内膜下见脂质沉积，中膜层弹力纤维排列较模型组及小剂量组整齐；芎芍大剂量及辛伐他汀组管壁内皮细胞尚连续，见散在薄斑块，内膜下少量泡沫细胞沉积，中外膜与对照组厚度相当，较模型组薄(图1)。

2.2 各组动脉管壁cav-1及亲环素A蛋白表达水平比较

正常组织丰富表达cav-1，AS模型兔表达量明显下降(P＜0.01)，与模型组相比，芎芍中、大剂量组cav-1表达增加(均为P＜0.05)，辛伐他汀组及芎芍小剂量组cav-1表达也有增加趋势，但无统计学意义(均为P＞0.05)。除芎芍小剂量组表达量下降(P=0.04)，各给药组与对照组相比差异无统计学意义，表明各给药组cav-1无过度表达。

正常组织亦表达亲环素A，AS模型组兔表达量较对照组增加(P=0.01)，芎芍中、大剂量组及辛伐他汀组较模型组亲环素A表达减少(P=0.02，P＜0.01)，芎芍各组与对照组相比亲环素A表达差异无统计学意义，辛伐他汀组较对照组表达量减少(P =0.04)，见图2，表1。

表1 各组cav-1及亲环素A蛋白表达水平及mRNA相对表达量比较(±s，n1=6；n2=6～9)

表1 各组cav-1及亲环素A蛋白表达水平及mRNA相对表达量比较(±s，n1=6；n2=6～9)

注:与空白对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01；n1每指标WB分别测定6个样本；n2对组内每样本兔测定real-time RCR，每组取材样本数在6～9之间

组别cav-1亲环素A蛋白水平mRNA表达量蛋白水平mRNA表达量空白对照组1.275±0.319 1.000±0.267 1.013±0.126 1.000±0.251模型组0.692±0.252b0.480±0.185a1.284±0.157a0.969±0.226芎芍小剂量组0.919±0.390 0.685±0.390 1.131±0.239 0.980±0.376芎芍中剂量组1.090±0.305c0.719±0.309 1.022±0.110c1.306±0.576芎芍大剂量组1.259±0.306d1.019±0.278d0.982±0.169d1.604±0.449d辛伐他汀组1.010±0.200 0.861±0.305c0.793±0.106d1.596±0.475d

2.3 各组动脉管壁cav-1 mRNA及亲环素A mRNA表达水平比较

各组基因的相对表达量见表1。与对照组相比，模型组cav-1 mRNA表达量明显下降(P＜0.01)，辛伐他汀组及芎芍大剂量组较模型组增加(均为P＜0.05)，各给药组与对照组无明显差异(均为P＞0.05)，基因未过表达。模型组兔亲环素AmRNA表达量与对照组比有下降趋势，但差异无统计学意义；芎芍大剂量组及辛伐他汀组较模型组相比明显增加(均为P＜0.01)，余给药组较模型组差异无统计学意义。

图1 各组兔主动脉粥样硬化比较(HE染色，×100)

图2 各组间cav-1及亲环素A表达(WB)

3 讨论

芎芍胶囊作为活血化瘀中药的代表，抗AS作用确切，能抑制平滑肌细胞增殖、减少血管重构、保护血管内皮、降低血脂［4-6，9-10］。小凹(caveolae)是细胞膜上的一种特殊的囊泡状凹陷结构，是细胞胆固醇流出的主要部位，cav-1在正常细胞中丰富表达并在小凹区域调控胆固醇的胞内转运，对维持细胞内胆固醇的动态平衡有着重要影响［11］。小凹还是信号转导中心，其他与胆固醇摄取和流出相关受体和蛋白如ABCA1、SR-BI等在该区域高度富集，协同胆固醇的跨膜转运，其中cav-1与亲环素A复合体是转运胆固醇的主要运载工具。

有研究显示，cav-1根据检测细胞的不同，可表现为AS前期或者抗AS的相对复杂作用［12］。过度表达的cav-1能够促进单核细胞向巨噬细胞转化［13］，促进炎症反应、内皮增生，从而加速AS进程［14］。这些实验从另一角度补充了小凹蛋白的负面作用，其与蛋白过度表达及炎症细胞/炎性因子密切相关。针对亲环素A的多数研究多侧重促炎方面，其参与胆固醇的正常转运，但在斑块中过度表达则表现为促炎作用，引发血管炎症反应和内皮细胞损伤，甚至有学者提出亲环素A比C反应蛋白与氧化应激和炎症有更强烈关联［15］。

本研究从病理形态学角度证明芎芍胶囊能够抗AS形成。实验结果中，模型组兔主动脉(主要是血管平滑肌细胞)cav-1表达量明显下降，可能与血管内氧化型低密度脂蛋白含量增高有关［16］。芎芍大剂量组与模型组相比，cav-1表达量明显增加，推测活血化瘀药物(芎芍胶囊)可能通过提高小凹蛋白水平促进平滑肌细胞胆固醇流出从而减轻其细胞泡沫化以达到抗AS的作用。这一作用可能与其减少了低密度脂蛋白的氧化修饰有关。相比模型组，辛伐他汀组cav-1 mRNA表达明显增多，应促进cav-1的生成，但在蛋白表达时可能受到其他因素减少其蛋白翻译或增加蛋白消耗等影响，最终蛋白水平与模型组无明显差异。

亲环素A在斑块中丰富表达，故模型组兔的蛋白水平较对照组明显升高，而芎芍大剂量组及辛伐他汀组蛋白水平明显减少，表明芎芍胶囊及辛伐他汀可能通过抑制其在斑块内过表达以减少炎症反应。值得讨论的是，各组亲环素A的mRNA水平与蛋白表达水平并不一致，且成相反趋势。可能的解释是:某些炎症因子促进了斑块中亲环素A的蛋白质合成，导致其表达增加，而对其基因水平无影响；芎芍胶囊和辛伐他汀在正常范围内促进亲环素A基因表达，从而合成更多转运复合体参与胆固醇转运。

本次研究发现，芎芍胶囊能够保障cav-1的正常表达，维护平滑肌细胞胆固醇转运过程；且能够减少斑块中亲环素A的过度表达，从而减少血管内皮损伤及炎症反应。

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Effect of Xiongshao capsule on caveolin-1 and cyclophilin A in rabbits w ith atherosclerosis

Zhang Yanhong1，Xu Fengqin2.
1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 Department of Senior Cadre Health，Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences

Objective To study the effect of Xiongshao Capsule(XSC)on the key reverse transcription protein caveolin-1(cav-1)and cyclophilin A in rabbits with atherosclerosis(AS)and to investigate the possible mechanism of XSC in preventing AS through promoting reverse cholesterol transport (RCT).Methods A total of 60 New Zealand rabbits were randomly divided into control group，model group，low-dose XSC group，middle-dose XSC group，large-dose XSC group and simvastatin group.The rabbits with AS were remodeled by feeding with simple hypercholesterol diet.The thoracic aortas were stripped for observation of artery plaque formation by HE staining after 15 weeks of drugs delivery.The cav-1 and cyclophilin A in aortas was tested by Western blotting(WB)and the expression of cav-1 and cyclophilin A mRNA in aortas was tested by Real-time PCR，which were designed to observe the effects of experiment drugs on proteins related to RCT proteins.Results Compared with control group，cav-1 inmodel group was significantly lower(P＜0.01).The cav-1 levels in middle-dose and large-dose XSC group were significantly higher(all P＜0.05)than in model group.The expression of cyclophilin A in model group was significantly higher than in control group(P=0.01)，and those in middle-dose and large-dose XSC group were significantly lower than in model group(all P＜0.01).Cav-1 mRNA in model group was significantly lower than in control group(P＜0.01).Cav-1 mRNA level in large-dose XSC group and simvastatin group were significantly higher(all P＜0.05)than in model group.The expression of cyclophilin A mRNA in model group and control group was similar(P=0.88)，and its expression in largedose XSC group and simvastatin group were significantly higher than in model and control groups(all P＜0.01).Conclusions XSC can regulate the expression of cav-1 and cyclophilin A，and the mechanism of its anti-atherosclerotic effect may involve the promotion of reverse cholesterol transportation in vascular smooth muscle cells.

Atherosclerosis； Caveolin-1； Cyclophilin A； Xiongshao capsule

Xu Fengqin，Email:doctorxu@aliyun.com

2013-12-09)

(本文编辑:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.02.011

国家自然科学基金项目(81173385)

100029北京中医药大学(张艳虹)；中国中医科学院西苑医院高干科(徐凤芹)

徐凤芹，电子信箱:doctorxu@aliyun.com注:张艳虹现为北京中医药大学在读博士生

This work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China(No.81173385)