宽叶金粟兰总黄酮的提取工艺及抗氧化活性研究

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(1. 广西民族大学化学化工学院,广西南宁 530006; 2. 广西林产化学与工程重点实验室,广西南宁 530006; 3. 广西民族大学海洋与生物技术学院,广西南宁 530006)

宽叶金粟兰(Chloranthushenryi)为金粟兰科金粟兰属植物,又名四块瓦、四大天王、大叶及己、四叶细辛等,产于陕西、甘肃、安徽、浙江、福建、江西、湖南、湖北、广东、广西、贵州、四川等地。全草入药,味辛,性温,有毒,具祛风除湿,活血散瘀,解毒的功效[1]。

药理实验研究表明金粟兰属植物多具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡、镇痛、抗血小板聚集、收缩子宫等活性[2]。目前,研究者已从宽叶金粟兰中分离出了萜类、香豆素类、甾体及甾体皂苷类等化学物质[3 - 5]。为了更好地开发宽叶金粟兰,笔者对其地上部分,即其茎和叶进行了化学成分预实验,发现其含有糖类、有机酸、黄酮类等化学物质。大多数天然黄酮类化合物都具有显著的生理活性,如降血压、降血脂,抗病毒、抗炎、抗氧化、抗菌等作用[6 - 8]。提取黄酮类化合物的方法有很多,最常用的方法有有机溶剂提取法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法等,而用微波辅助提取宽叶金粟兰黄酮的文章几乎未见报道。本研究采用微波辅助提取法对宽叶金粟兰黄酮进行提取,并结合单因素实验和正交实验筛选出最佳的工艺条件。同时通过对宽叶金粟兰黄酮提取物的还原力、DPPH自由基清除率及羟基自由基清除率的测定,对其抗氧化活性进行了评估,以期为宽叶金粟兰的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

宽叶金粟兰 购于广西玉林中药材市场;芦丁对照品,含量98%,批号100080 - 200707 购自中国食品药品检定研究院;其余试剂均为分析纯;水为超纯水。

UV - 1800岛津紫外可见分光光度计 苏州岛津仪器有限公司;XH - MC - 1型祥鹄实验室微波合成反应器 北京祥鹄科技发展有限公司;PL203电子天平 梅特勒 - 托利多仪器有限公司;SPS401F型电子天平 奥豪斯国际贸易有限公司;AJF - 1001 - U型基础性纯水器 艾科浦公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 总黄酮提取 将宽叶金粟兰洗净烘干,粉碎并过60目筛,备用。取宽叶金粟兰粗粉5. 0g,于500mL烧瓶中加入适量乙醇溶液,在60℃恒温水浴中浸泡1h后,设微波温度为60℃,在设定的实验条件下(微波时间、微波功率、液料比和乙醇浓度等),采用微波辅助提取法提取宽叶金粟兰中总黄酮。提取液经活性炭超声脱色20min后,收集滤液,置于旋转蒸发仪减压浓缩,再用50%乙醇溶液溶解并定容于100mL的容量瓶中,作为样品溶液待测。

1. 2. 2 标准曲线的绘制

1. 2. 2. 1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品18. 1mg,用50%乙醇溶液溶解,定容至100mL摇匀,配成0. 1810mg/mL的芦丁对照品溶液,备用。

1. 2. 2. 2 测定波长的选择 取对照品溶液5. 0mL置于25mL容量瓶中,加入5%的亚硝酸钠溶液1. 0mL,摇匀,静置6min,加入10%硝酸铝溶液1. 0mL,摇匀,静置6min,加入4%氢氧化钠溶液10. 0mL,再加入50%乙醇溶液定容,摇匀,放置15min后,用紫外 - 可见分光光度计在400 ～ 600nm范围内扫描。根据紫外吸收光谱图确定检测波长为510nm。

1. 2. 2. 3 标准曲线的绘制 精密量取0. 1810mg/mL的芦丁对照品溶液0. 0、2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. 0mL分别置于6个25mL的容量瓶中,按“1. 2. 2. 2”项下方法显色后,在波长510nm下测定吸光度值,绘制标准曲线。

1. 2. 3 样品总黄酮含量的测定 精密量取样品溶液1. 0mL置于50mL容量瓶中,加入5%的亚硝酸钠溶液2. 0mL,摇匀,静置6min,加入10%硝酸铝溶液2. 0mL,摇匀,静置6min,加入4%氢氧化钠试液20. 0mL,再加入50%乙醇溶液定容,摇匀,放置15min后在510nm处测定吸光值。利用回归方程可计算出总黄酮含量。

1. 2. 4 单因素实验 a. 精密称取宽叶金粟兰5份,按料液比1∶ 30,分别添加不同体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇溶液,60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波温度,处理15min。b. 精密称取宽叶金粟兰5份,按料液比1∶ 30添加60%乙醇溶液,60℃水浴浸泡1h,然后以不同的微波功率(200、300、400、500、600W),60℃的微波温度,处理15min。c. 精密称取宽叶金粟兰6份,按料液比1∶ 30,添加60%乙醇溶液,在60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波温度,按不同时间(5、10、15、20、25、30min)处理。d. 精密称取宽叶金粟兰5份,分别按不同的料液比(1∶ 20、1∶ 30、1∶ 35、1∶ 40、1∶ 50)添加60%乙醇溶液,在60℃水浴浸泡1h,然后以400W的微波功率,60℃的微波温度,处理10min。

1. 2. 5 正交实验设计 根据单因素实验结果,以不同乙醇体积分数(A)、微波功率(B)、微波处理时间(C)、料液比(D)为考察因素,宽叶金粟兰总黄酮提取率为考察指标,选用L9(34)正交表设计,探讨最佳提取工艺条件。各因素水平见表1。

1. 2. 6 抗氧化活性测定

1. 2. 6. 1 清除DPPH自由基能力的测定 参考文献[9 - 11]，按最优工艺条件提取得的黄酮浓缩物,用50%乙醇溶液溶解并定容于100mL的容量瓶中,得到样品溶液,测定其黄酮的质量浓度为6. 0mg/mL,再稀释配制成含黄酮的质量浓度为0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8mg/mL的样品溶液。在试管中依次加入0. 2mmol/L的DPPH乙醇溶液5. 0mL,再加入5. 0mL不同浓度的样品溶液。振荡器混匀后,室温,避光放置30min后于517nm 下测定吸光度,计算清除率。

清除率(%)=[1 - (A1- A2)/A0]×100

接着，徐通理给他细细解释“色即空，空即色”的处世哲学：他们把人生所需要的能看得见摸得着的东西都归纳为色，把无求无欲的崇高的为人道德归纳为空。人只有达到无求无欲这种“空”的境界，才能求得正果而获得一切。如果只求“色”的东西，求来求去，越求反而离自己所需的东西越远了。接着，老人又说，普通人大多一味地只求“色”的东西，这么一味地求下去，就叫作尘缘未了。

式中:A0为DPPH·溶液5. 0mL+无水乙醇5. 0mL的吸光值;A1为DPPH·溶液5. 0mL+样品溶液5. 0mL的吸光值;A2为样品溶液5. 0mL+无水乙醇5. 0mL的吸光值。

同法以相同浓度的VC做对照实验,所有测定平行操作3次,取平均值。

1. 2. 6. 2 清除羟基自由基能力的测定 参考文献[12 - 14]，在试管中分别加入2mL pH=7. 4的磷酸盐缓冲液,0. 3mL 5mmol/L邻二氮菲溶液,充分混匀后,加入0. 2mL 7. 5mmol/L 硫酸亚铁溶液,每加一管后立即混匀。然后向其中加入不同黄酮质量浓度的样品溶液,混匀,再加入1%的双氧水1mL,最后补充体积至8mL。另再做损伤管和未损伤管,其中损伤管中加入1%的双氧水1mL,未损伤管不加双氧水,最后补充各管体积至8mL。于37℃下保温1h,在536nm下测吸光值。同法以相同浓度的VC做对照实验,每个实验组重复3次,求得平均值,按下式计算清除率。

清除率(%)=(A样- A损)/(A未损- A损)×100

式中:A未损为未损伤管的吸光值;A损为损伤管的吸光值;A样为加样品液的吸光值。

1. 2. 6. 3 还原能力的测定 参考文献[15 - 17]，分别准确吸取2. 0mL不同黄酮质量浓度的样品溶液,各加入0. 2mol/L pH6. 8磷酸缓冲液2. 5mL,再加1%的铁氰化钾溶液2. 5mL,50℃水浴20min后急速冷却,加入10%的三氯乙酸溶液2. 5mL,于4000r/min离心10min,取上清液2. 5mL,加蒸馏水2. 5mL,0. 1%的三氯化铁溶液0. 5mL,混合10min后于700nm波长处测定吸光度。以VC作为对照样品,每组实验重复3次后求得平均值,绘制总还原能力变化曲线。

2 结果与分析

2. 1 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程为y=11. 417x -0. 0078,R2=0. 9996;结果表明芦丁在0. 01448 ～0. 07240mg/mL范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

2. 2 单因素实验

2. 2. 1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 由图1可知,总黄酮的得率随乙醇体积分数的增加而先上升后下降。当乙醇体积分数达到60%时,总黄酮得率最高,之后开始呈下降趋势。分析其原因可能是因为物料中的水分子是主要的微波能吸收者,可以产生大量热使物料升温,随着乙醇体积分数的增加,水的比例减少了,使物料升温减慢从而影响了得率。另外高浓度乙醇使细胞内蛋白质凝固,黄酮不易溶出。因此,初步确定最佳乙醇体积分数为60%。

图1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig. 1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

2. 2. 2 微波功率对总黄酮得率的影响 由图2可知,黄酮的得率随微波功率的增加而逐渐提高,当微波功率达到400W时,总黄酮提取率达到最大值,之后随着微波功率的增加,含量呈下降趋势。分析其原因,微波功率增大,对细胞的破坏力增强,细胞的溶出物增多,黄酮得率增高。但微波功率过高,会造成样品中细胞内蛋白质变性,从而影响黄酮类物质的溶出。因此,最佳微波功率选定400W。

图2 微波功率对提取效果的影响Fig. 2 Effect of microwave power on extraction

2. 2. 3 微波处理时间对总黄酮得率的影响 由图3可知,黄酮的得率随微波作用时间的增加而提高,当微波处理时间达到10min时,总黄酮得率最高,之后随着微波处理时间的增加,呈下降趋势。这可能是在一定的功率下微波时间越长,温度越高,对细胞的破坏就越完全,溶出物也越多,得率呈上升趋势。 但过长的微波时间会导致部分黄酮受热变质,黄酮得率反而下降。因此,最佳微波处理时间初步选定10min。

图3 微波处理时间对提取效果的影响Fig. 3 Effect of microwave time on extraction

2. 2. 4 料液比对总黄酮得率的影响 由图4可知,当料液比达到1∶ 30时,总黄酮得率最高,之后随着溶剂的增加,含量呈下降趋势。这是由于增加溶剂量有利于黄酮的溶出,但继续加大溶剂量会影响提取体系的传热和传质,从而影响黄酮的提取。因此,最佳料液比选定1∶ 30。

图4 料液比对总黄酮得率的影响Fig. 4 Effect of solid to liquid ratio on extraction

2. 3 正交实验

2. 3. 1 正交实验结果 正交实验和方差分析结果见表2和表3,由极差分析可知各因素对宽叶金粟兰总黄酮提取率的影响大小顺序依次为:A>C>D>B,即乙醇体积分数和微波处理时间影响最大,微波功率影响最小;方差分析表明A因素和C因素具有显著性,是影响提取效果的重要因素。故最佳提取条件为:A3B2C2D2,即乙醇体积分数为60%、微波功率为300W、微波处理时间为15min、料液比为1∶ 30。

表2 正交实验结果Table 2 The results of orthogonal test method

表3 方差分析结果Table 3 The results of variance analysis

注：F0.05(2,2)=19. 0；F0.01(2,2)=99. 0。

2. 3. 2 验证实验 按照正交实验获得的最优组合:即乙醇体积分数为60%、微波功率为300W、微波处理时间为15min、料液比为1∶ 30,进行微波辅助提取实验,重复5次平行操作,其总黄酮的平均得率是6. 11%。结果优于正交实验中的最高得率,表明通过正交实验研究达到了优化目的。

2. 4 宽叶金粟兰总黄酮体外抗氧化能力

2. 4. 1 清除DPPH自由基的能力 从图5 可以看出,随着样品质量浓度的增加(由0. 2 ～ 0. 8 mg/mL),宽叶金粟兰黄酮对DPPH自由基的清除率从72. 4% 增加到76. 2%。与同等质量浓度的VC相比较,宽叶金粟兰黄酮对DPPH自由基的清除率略低于VC的清除率。在实验浓度范围内,VC对自由基的清除率在77. 8% ～ 85. 3%范围内。

图5 宽叶金粟兰黄酮提取物和抗坏血酸对DPPH自由基的清除作用Fig. 5 Scavenging effect of extract and VC on DPPH radical

2. 4. 2 清除羟基自由基的能力 由图6可知,两者对清除羟基自由基均有较好的量效关系。当提取物的浓度由0. 2mg/mL 增加至0. 8mg/mL 时,其对羟基自由基的清除率由2. 23% 上升到 100%。在小于0. 5mg/mL的质量浓度下,宽叶金粟兰黄酮的清除羟基自由基能力低于VC;质量浓度大于0. 5mg/mL时清除能力呈逐渐增强趋势,宽叶金粟兰黄酮的清除羟基自由基能力明显高于VC。

图6 宽叶金粟兰黄酮提取物和抗坏血酸对羟自由基的清除作用Fig. 6 Scavenging effect of extract and VC on hydroxyl free radical

2. 4. 3 还原力 由图7可知,反应体系中,宽叶金粟兰黄酮提取物的样品溶液与VC的吸光度都随质量浓度的增加而增大,在0. 2 ～ 0. 5mg/mL的浓度下,两者的还原能力接近且具有相似的上升趋势;0. 6mg/mL的浓度下两者还原能力有较大差距;0. 7 ～ 0. 8mg/mL的浓度下还原能力又趋于接近。说明宽叶金粟兰黄酮提取物具有较强的还原能力。

图7 宽叶金粟兰黄酮提取物和抗坏血酸的还原能力Fig. 7 Reducing power of extract and VC

3 结论

3.1本文采用微波辅助提取法探索了各单因素对宽叶金粟兰中总黄酮得率的影响,并进行了正交实验。结果表明,微波辅助提取宽叶金粟兰总黄酮的最佳工艺条件为:乙醇体积分数60%、微波功率300W、微波处理15min、料液比为1∶ 30。在上述最佳工艺条件下进行验证实验,得到总黄酮得率为6. 11%,结果高于正交实验中的最高提取率,表明通过正交实验研究达到了优化目的。微波提取法操作简单,可以极大地缩短提取时间,且能达到较高的提取效率,是一种较为理想的提取宽叶金粟兰总黄酮的方法。

3.2体外抗氧化活性实验表明,宽叶金粟兰总黄酮具有很强的自由基清除力和还原能力,在一定范围内,清除效果随着质量浓度的升高而加强,具有明显的量效关系。在实验浓度(0. 2 ～ 0. 8mg/mL)范围内,宽叶金粟兰黄酮对羟基自由基的清除率可达到100%,对DPPH自由基的清除率可达到76. 2%。与VC相比,宽叶金粟兰黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力略低于同质量浓度的VC,但其黄酮提取物对羟基自由基的清除能力与同质量浓度的VC相当,甚至在质量浓度较高时,超过VC。这可能是因为金粟兰黄酮提取物对不同的自由基表现的敏感性不同。同时,金粟兰黄酮提取物还有与VC相当的还原能力。总的来说,宽叶金粟兰黄酮提取物具有较强的抗氧化活性,这预示着它在医学和人类保健事业上有着潜在的利用价值,具有一定的开发和应用前景。

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