同位素稀释质谱法测定人绒毛促性腺激素的含量*

张晓光　黄　挺　宋德伟　武利庆　杨　屹　全　灿　李红梅

(1.北京化工大学 理学院，北京 100029；2.中国计量科学研究院，北京 100029)

0　引言

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)是一种由胎盘的滋养层合体滋养叶细胞所分泌的蛋白质类的激素，是一个由a 亚基和β亚基构成的蛋白，a 亚基有92个氨基酸，β亚基有145个氨基酸[1]。是重要的临床标志物，在人体内的含量可以作为怀孕、癌症等的诊断标准，如先兆流产、滋养叶细胞癌等胚胎性肿瘤[2-3]。由于人绒毛促性腺激素在临床上的重要性，其标准物质研制是必要的。而其准确定量方法是前提。

目前，人绒毛促性腺激素在临床上的主要是通过免疫或者发光试剂盒来测定其含量。虽然试剂盒有检测快速、简便、易于推广等特点，但是灵敏度、通用性的局限性导致试剂盒不能广泛应用。近年来质谱在临床蛋白质组学和检测中成为一个日益成熟的检测手段[4-5]。质谱的检测方法很多，其中同位素稀释质谱法是唯一一种微量、痕量和超痕量元素权威测量的方法[6]。同位素稀释质谱法(IDMS)是利用同位素标记的目标物的类似物作为内标, 最大程度地消除了化学处理过程带来的影响方法，处理过后的样品再经色谱分离、质谱检测，使其测量干扰很少，是目前复杂机体微量成分测量的最准确的方法之一。IDMS 可以通过天平称重和同位素丰度比的质谱测量，将化学成分分析转化为同位素丰度的质谱测量。IDMS具有绝对测量性质；灵敏度高；方法准确；测量的动态范围宽等特点[7]。同时样品制备不需要严格分离。测量值能够直接溯源到国际基本单位制的物质量基本单位。

由于hCG的分子量较大，不能使用质谱直接进行定量分析。并且蛋白质在酸性高温条件下会水解成氨基酸及肽段，完全水解后的产物是混合的氨基酸。将蛋白质水解后分离，并监测产物，得到氨基酸的含量。根据氨基酸和蛋白质的对应关系可得出蛋白质的含量[8]。

本文建立了人绒毛促性腺激素的水解-同位素稀释质谱的含量测量方法，在测量中只需要氨基酸的标准物质，就可以保证蛋白质含量测定的可溯源性。该方法提高了测定蛋白质含量的准确度，减少了方法的不确定度。

1　实验部分

1.1　主要仪器及试剂

6410型液相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；N-EVAP111型氮吹仪(美国Organomation公司)；UFE500型烘箱(德国Memmert公司)；SW23型振荡水浴槽(德国JULABO公司)；Vacucell型真空干燥箱(德国MMM公司)；XP26型分析天平(最大量程22g，精度0.001mg，瑞士Mettler-Toledo公司)；ME235S型分析天平(最大量程230g，精度0.01mg，德国Sartorius公司)。

乙腈(色谱纯，德国Merck)；全氟庚酸、三氟乙酸(美国Sigma)；盐酸(优级纯，北京化学试剂公司)；甲酸(分析纯，北京化学试剂公司)；人绒毛促性腺激素(美国sigma)；13C5-L-缬氨酸、13C9-L-苯丙氨酸和13C5-L-脯氨酸(98%，美国CIL公司)；缬氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸(纯度分别为99.4%、99.9%、99.0%，国家标准物质)。

1.2　样品及标准品的配制

本实验配制样品和标准溶液用的都是质量称量法。所取样品、标液及水都要准确称取质量。

1)准确称取1.063mg人绒毛促性腺激素溶于2.104g水中，配制成0.5050mg/g的hCG蛋白质储备溶液。

2)用苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、以及对应的三种标记氨基酸，分别配制六种氨基酸储备溶液。

3)分别取三种非标记的氨基酸混标储备溶液，溶于10mL水中，配制非标记氨基酸混标储备液。

4)分别取三种标记的氨基酸混标储备溶液，溶于10mL水中，配制标记氨基酸混标储备液。

5)配制低标溶液：分别称取非标记和标记的氨基酸混标溶液，使其中的非标记氨基酸比相应的标记氨基酸含量略低(比值约为0.9)。

6)配制高标溶液：分别称取非标记和标记的氨基酸混标溶液，使其中的非标记氨基酸比相应的标记氨基酸含量略高(比值约为1.1)(见表1)。

7)配制样品溶液：称取的hCG蛋白质储备溶液，加入一定量的标记氨基酸混标溶液，使hCG水解后的氨基酸和加入的标记氨基酸的比值约为1。

表1　氨基酸的储备液及混标配制

1.3　样品的处理

把称量好的的样品放入40℃真空干燥箱中干燥，干燥后，等样品恢复到室温，加入6mol/L的盐酸500μL。然后在样品瓶中充入高纯氮2min，并密封。之后放入110℃烘箱水解。称量平行样品，分别水解12h、24h、36h、48h和60h。水解结束后的样品使用氮吹仪吹干。用0.1%的甲酸水溶液复溶。经过0.23μm滤膜过滤后，进行液相色谱质谱仪分析，样品待分析前在-20℃保存。

1.4　色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱Aglient的SB-AQ C18150mm×2.1mm×5μm，柱温：40℃，流动相A相：0.8mmol/L 全氟庚酸和0.05% 三氟乙酸的水溶液。B相：乙腈。流动相梯度见表2。

质谱条件：干燥气流速为8L/min；毛细管温度350℃；毛细管电压为4000V。

1.5　样品分析

使用上述已优化好的条件进行分析。质谱采用多离子监测模式(MRM)模式对样品进行监测。方法中采用的是已经优化好的定量检测离子对Phe：m/z=166→120，L-Phe：m/z=175→128； Pro：m/z=116→70；L-Pro：m/z121→74；Val：m/z=118→72, L-Val：m/z123→76。

表2　流动相梯度表

1.6　蛋白质含量的计算

根据一个氨基酸计算的样品溶液中蛋白质的溶液按式(1)计算：

(1)

式中，P为氨基酸标准物质的纯度；H为人绒毛促性腺激素水解效率；mS为标记的苯丙氨酸的质量(g)；RS为样品的质谱峰面积比；I1为低标中非标记苯丙氨酸/标记苯丙氨酸质量比；I2为高标中非标记苯丙氨酸/标记苯丙氨酸质量比；R1为低标的质谱峰面积比；R2为高标的质谱峰面积比；m为样品溶液质量(g)；caa为根据一个氨基酸算出的样品溶液中毛膜促性腺激素蛋白质的浓度(g/g)(aa分别是Phe、Pro、Val三种氨基酸)；MhCG为人绒毛膜促性腺激素蛋白质分子量；Maa为对应氨基酸的分子量。n为人绒毛膜促性腺激素蛋白质序列中对应的氨基酸个数(根据人绒毛膜促性腺激素蛋白质序列中对应的氨基酸个数的Phe：6个；Pro：29个；Val：19个)。

然后，由三个氨基酸计算出储备溶液中蛋白质的浓度c(g/g)按式(2)计算：

(2)

人绒毛膜促性腺激素蛋白质的质量分数，按式(3)计算：

(3)

式中，X为人绒毛膜促性腺激素蛋白质的质量分数(g/g)；mhCG为称取人绒毛膜促性腺激素蛋白质的质量(g)；mwater为溶解人绒毛膜促性腺激素蛋白质的水的质量(g)。

2　结果与讨论

2.1　样品水解后的MRM检测

图1为水解后的样品，经过液相分离并采用MRM模式监测上述三种氨基酸的离子对的同位素稀释质谱的典型谱图。图中三种氨基酸能达到分离。

2.2　水解时间对蛋白质水解效率的影响

水解时间是影响蛋白质水解效率的最主要因素。水解时间短会导致蛋白质没有完全水解成氨基酸，而导致氨基酸定量蛋白质的结果偏低。水解时间太长会导致氨基酸在强酸环境下进一步反应。同样也会造成定量结果的不准确。

(从上至下分别为Phe、L-Phe、Pro、L-Pro、Val、L-Val的色谱质谱图)

通过称量平行样品水解不同时间来确定人绒毛促性腺激素的完全水解时间，如图2。从图中可以得出，人绒毛促性腺激素随着时间递增一开始氨基酸的比例也迅速递增，24h后趋势缓慢，说明随着水解的进行，氨基酸的含量不断增加，样品中hCG的含量不断减少导致水解反应速率降低，使比例递增缓慢。当到48h后比例达到最大值，如果时间再长，氨基酸的比例会降低。说明hCG在48h的时候就达到完全水解，再继续水解会导致氨基酸的副反应。从而使其比例降低。

图2　水解时间对hCG水解程度的影响

2.3　同位素稀释质谱法测定样品含量

在进行分析时候按“低标-样品-高标”的顺序进行检测。把水解相同时间的样品分为一组，水解48h的平行样品为6个。经过计算得到6个样品的hCG分别以Phe、Pro、Val为标准的含量如表3：

表3　人绒毛促性腺激素含量

2.4　测量结果的不确定度评价

2.4.1元素的原子量和不确定度

人绒毛促性腺激素样品通过胰蛋白酶酶切鉴定后得到的其由a 亚基(92个氨基酸)和β亚基(145个氨基酸)构成。

人绒毛促性腺激素的蛋白质分子中含有元素C:1105个，H:1756个，O:311个，N:322，S:26个。对每个元素来说，其标准不确定度可按IUPAC给出的数值求得(见表4)。计算hCG的摩尔质量的不确定度为：u(MhCG)=[(1105(0.000462)2+(1756×0.000040)2+(311×0.000173)2+(322×0.000115)2+(26×0.002887)2]1/2=0.2755(g/mol)，与hCG的分子量相比远小于0.1%，可以忽略不计。

表4　元素的原子量和不确定度

2.4.2储备溶液中蛋白浓度c的相对标准不确定度ur(c)

先算出苯丙氨酸的蛋白浓度值的相对标准不确定度ur(cPhe)：

2)称量样品及标准品引入的不确定度，由于使用精度为0.001mg的天平称量0.5～1mg的样品，用精度为0.01mg的天平称量100～200mg的样品，因此，天平称量的相对不确定度小于0.1%，可以忽略不计(B类不确定度)。

3)由水解效率引入的不确定度ur(HPhe)为1%(B类不确定度)。

4)由苯丙氨酸纯度标准物质引入的相对不确定度ur(PPhe)。由标准证书得到国家二级标准物质苯丙氨酸的相对标准不确定度为0.8%(B类不确定度)。

5)相对合成不确定度ur(cPhe) 。合成不确定度等于以上各项平方和的开方，即ur(cPhe)=1.5%。

同理可以算出由脯氨酸(Pro)，缬氨酸(Val)浓度值相对不确定度ur(cPro)，ur(cVal)具体数值见表5，则蛋白浓度c的相对标准不确定度由三个氨基酸的溶液值不确定度平方和开方再除以3算得，见表5。

表5　由氨基酸浓度引入的不确定度

蛋白浓度c的相对标准不确定度由三个氨基酸的溶液值不确定度平方和开方再除以3算得：

2.4.3蛋白定值质量分数X的不确定度ur(X)

蛋白定值质量分数的相对扩展不确定度为：Ur(X)=k×ur(X)=2×1.5%=3.0%(k=2)

蛋白定值质量分数不确定度：u(X)=ur(X)×X=1.5%×0.555=0.008(g/g)

蛋白定值质量分数扩展不确定度：U(X)=u(X)×k=0.008×2=0.016(g/g)

终上所述，hCG测量结果，即hCG定值质量分数的不确定度为0.008g/g，扩展不确定度为0.016g/g(k=2)。

3　结语

本文首次建立了人绒毛促性腺激素水解-同位素稀释质谱的方法。人绒毛促性腺激素在110℃，6mol/L的HCl水解48h达到完全水解，得到其质量分数为：0.555g/g。并且进行了测定结果的不确定度评估，不确定度为：0.016g/g(k=2)。同时可以通过氨基酸直接溯源到氨基酸标准物质。为蛋白质标准物质的研制奠定了基础。

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