动物源抗菌肽的研究现状和展望

汪以真

(浙江大学饲料科学研究所，生物饲料安全与污染防控国家工程实验室，动物分子营养学教育部重点实验室，农业部华东动物营养与饲料重点实验室，杭州 310058)

抗菌肽，又名宿主防御肽，是机体抵抗外来致病菌侵袭的重要屏障。成熟抗菌肽一般包含12～100个氨基酸残基，由于其带正电荷、呈两亲性的分子结构，使得其便于与带负电荷的微生物膜或其他细胞靶点相互作用［1］。人们一直认为抗菌肽具有广谱抗菌、不易产生耐药性、无残留等优点，然而随着对抗菌肽研究的不断深入，人们发现它并不是“万能的”，某些细菌仍然能对抗菌肽产生耐药性，而且某些抗菌肽对动物体内的益生菌也有一定的杀伤作用。另外，外源抗菌肽的吸收、在动物体内的稳定性以及与抗生素相互影响等都不甚明了。鉴于此，本文从生物学功能与作用机制、稳定性与吸收、表达规律与营养调控、分子改良以及重组表达6个方面对动物源抗菌肽的研究现状作一系统阐述。

1 抗菌肽的生物学功能及作用机制

1.1 抗菌肽的抗菌功能与机制

抗菌肽可以通过破坏细菌细胞膜作用，直接快速地杀伤细菌，且抗菌谱广。其自身独特的氨基酸组成、大小、电荷、空间构像和结构、两亲性、疏水性和膜的流动性及组成等使得其拥有独特的抗菌机制。尽管目前尚没有一个涵盖所有抗菌肽作用机制的理论，但大家公认的主要为膜作用机制和胞内作用机制［2］。

细菌、真菌和真核生物细胞膜是大多数抗菌肽作用的首要靶点。抗菌肽通常定位在细菌膜的表面，当肽浓度达到一定阈值时破坏细菌细胞膜［3］。而抗菌肽作用于微生物细胞膜包括非受体结合和受体结合2种机制。多数微生物外层带负电荷与阳离子抗菌肽非受体结合，有学者观察了10种不同动物源的抗菌肽对革兰氏阴性菌大肠杆菌(如 ATCC25922)和革兰氏阳性菌(如ATCC25923)的作用机制，结果表明，大多数受试抗菌肽都能破坏细菌细胞膜，使其内容物泄漏，出现空泡化，此外还发现抗菌肽Protegrin-1(PG-1)具有胞内作用靶点，能够与细菌DNA结合，抑制蛋白质合成［4-5］。其他研究者也发现一些抗菌肽具有破膜机制和多种胞内作用机制，如Lv等［6］发现多种杂合肽透过细菌细胞膜，破坏膜完整性导致细菌死亡;Lan等［7］发现抗菌肽Gloverin 能抑制 RNA 合成;Hwang 等［8］、De Smet等［9］先后发现抗菌肽Indolicidin、PR39和Attacins能抑制蛋白质合成。

最新研究表明，抗菌肽的杀菌机制远非如此。Chu等［10］报道抗菌肽α-Defensin 6可以结合到细菌表面，自我组装形成一些小纤维和纳米样纤维包裹在鼠伤寒沙门氏菌周围，减少细菌黏附到肠道黏膜进而保护机体。本课题组也发现猪源hepcidin能够使大肠杆菌K88发生聚团，形成网状结构包裹。

1.2 抗菌肽的免疫调节作用与机制

抗菌肽在机体内的浓度低于2 μg/mL，远小于其杀菌浓度，但却可以在生理环境下调节免疫细胞功能。越来越多的研究表明免疫调节活性是抗菌肽发挥的主要生物学功能［11-12］。抗菌肽的免疫调节功能主要包括:1)调节机体炎症水平。抗菌肽发挥炎症调节功能依赖多种机制，如Niyonsaba等［13］研究表明，人抗菌肽LL-37能抑制核转录因子-κB(NF-κB)亚单位 p65的移位，激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路选择性上调抑炎因子的表达;Mookherjee［14］也发现 LL-37 通过与脂多糖(LPS)直接结合，从而抑制Toll样受体(TLR)4及下游信号通路的激活等。同时LL-37可以降低LPS诱导的小鼠及人嗜中性粒细胞［14］、树突状细胞［15］和B淋巴细胞［11］的促炎因子的异常高表达。2)通过诱导或增加趋化因子的分泌间接发挥趋化作用。Niyonsaba等［13］研究发现，在低生理浓度下，抗菌肽能够诱发免疫细胞趋化因子的产生。如人防御素可通过诱导肥大细胞脱粒和激活来招募中性粒细胞，进一步刺激支气管上皮细胞中白细胞介素8(IL-8)的转录和分泌。在稍高生理浓度下，抗菌肽自身作为趋化因子，募集粒性白细胞到感染部位发挥先天和适应性免疫反应作用。如LL-37可以介导CXCR2受体和甲酰肽受体2(FPR2)增加钙离子流出，进而趋化外周血单核细胞和嗜中性粒细胞;Yang 等［16］和 Zhang 等［17］研究发现，LL-37同时通过激活FPR2诱导单核细胞的趋药性。相似的，人β-防御素2(hBD-2)、人β-防御素3(hBD-3)可以通过CC类趋化因子受体2(CCR2)趋化单核细胞［17］。3)启动和调节特异性免疫。若先天性免疫不足以消除感染，抗菌肽则通过信号传递途径启动并扩大宿主的特异性免疫反应。Gracia等［18］研究结果表明，注射蛋白转导域(PTd)和抗菌肽HH2-CpG可以提高100倍免疫球蛋白G(IgG)的分泌水平，并提高免疫球蛋白亚型IgG2a和IgG1的抗体水平。4)直接增强机体抗细菌感染能力。Chromek 等［19］和 Nizet等［20］研究表明，CRAMP基因敲除小鼠在链球菌A的感染下更易导致皮肤坏死，并且更容易引起泌尿系统的感染。5)通过特异受体激活免疫细胞功能。Lande等［21］和 Vandamme 等［22］研 究结果表明，LL-37与自身DNA形成复合体，进而通过TLR9信号通路激活浆细胞样DC细胞，引起干扰素γ(IFN-γ)的产生与自免疫型T细胞的激活。

1.3 抗菌肽的屏障作用与机制

动物肠道、泌尿道和呼吸道的上皮细胞均可表达抗菌肽，近年来诸多研究表明抗菌肽在动物黏膜和皮肤防御方面起重要作用。抗菌肽发挥的作用不仅是杀灭病原菌，还能通过增强上皮组织的屏障功能来提高机体对病原微生物的抵抗能力。如Otte等［23］发现LL-37能够诱导血管内皮生长因子和角质形成细胞生长因子等多种细胞生长因子表达，刺激肠上皮细胞生长，保证肠上皮组织屏障的完整性，还能够通过与纤维状肌动蛋白发生作用使得肺泡上皮细胞硬度增加，从而增强机体对铜绿假单孢菌入侵的防御能力;肠上皮细胞间紧密连接可以调节肠黏膜屏障通透性和维持肠上皮细胞紧密性，是肠道黏膜屏障中至关重要的结构，而近年来有研究表明抗菌肽可以调控紧密连接蛋白的表达，从而影响肠道黏膜屏障的通透性。如人β-防御素1(hBD-1)和hBD-3可以提高表皮角质细胞紧密连接蛋白表达量，降低细胞通透性［24］;饲喂抗菌肽BFⅡ可以提高断奶仔猪肠道紧密连接蛋白occludin、claudin-1和ZO-1的表达量，保护小肠肠道黏膜的完整性［25］。刘倚帆［26］发 现 蛇 源 Cathelicidin-BF(C-BF)可 以 通 过MAPK信号通路提高猪空肠上皮细胞IPEC-J2紧密连接蛋白ZO-1、occuludin的表达量，保护机体肠道屏障结构的完整性。而某些抗菌肽对上皮细胞的作用正好相反，如蜂毒素可以在短时间内打开细胞间的紧密连接，使得细胞通透性突然增加［27］。

2 抗菌肽与抗生素的互作效应

一些抗菌肽与抗生素间存在互作效应。刘倚帆［26］研究了抗菌肽与抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的体外协同抗菌效果，结果表明，牛乳铁蛋白肽(LFcin B)、天蚕素A(Cecropin A)与金霉素对革兰氏阴性菌及阳性菌均具有协同作用;PG-1和C-BF与金霉素和新霉素联用对大肠杆菌EPEC O78∶K80有协同作用。国内外研究学者也报道了多种抗菌肽与抗生素之间的互作效应。如Westerhoff等［28］研究表明，来源于非洲爪蟾的抗菌肽magainina-2和PGLa具有协同作用，Vorland等［29］发现红霉素和LFcin B联合使用对大肠杆菌具有协同抗菌作用。保育猪和断奶仔猪生长性能的试验也验证了抗菌肽与抗生素的互作效应［30-31］，另有研究发现抗菌肽RSPR与硫酸链霉素、乳酸甲氧嘧啶、恩诺沙星联合应用都表现出拮抗效应［32］。

3 抗菌肽的稳定性和吸收

目前，国内外研究者对于抗菌肽的生物活性、作用机制等研究已较深入，而真正能转化为产品的抗菌肽却寥寥无几，且基本是用于局部治疗，究其原因，主要是由于天然抗菌肽的稳定性及利用效率不理想。虽然部分抗菌肽在体外具有耐高温、耐酸碱、耐反复冻融等特性［33］，但是研究学者普遍认为抗菌肽在体内的稳定性非常差，因为抗菌肽作为肽类物质，极易被体液中的多种蛋白酶降解而失去活性，尤其是经口服时，消化道中大量的胃蛋白酶、胰蛋白酶等可以轻易降解肽类物质，如LL-37与胰蛋白酶混合孵育6 h会被完全降解失去活性［34］。近年来，研究者们提出诸多改善抗菌肽稳定性的方法，如Carmona等［35］利用D-氨基酸替代抗菌肽Pin2固有的L-氨基酸后，其抗菌活性基本没有改变，而D-Pin2能够在血清、胰蛋白酶等环境下仍然保持抗菌活性。

在提高稳定性的同时，抗菌肽的利用效率问题也应该受到重视。目前，关于抗菌肽经口服后在消化道停留的时间、是否能通过肠道吸收等问题还鲜有报道。此外，若抗菌肽被吸收或经注射入血，其在体内代谢情况的研究也较少。王升兰等［36］测定了不同时间点抗菌肽S-sanatian在动物体内的血药浓度变化，分析其在大鼠体内的半衰期为1.5 h左右。

4 抗菌肽的表达规律与营养调控

4.1 动物体抗菌肽表达规律

抗菌肽在动物体内的表达存在品种差异和组织特异性。Gao等［37］比较了抗病力不同的地方品种莱芜猪、荣昌猪和藏猪，以及外来品种长白猪体内的Cathelicidin抗菌肽PR-39的品种与组织表达差异，结果表明:地方品种猪PR-39基因表达量总体上高于长白猪，骨髓是猪PR-39基因表达的主要部位。Chen等［38］研究发现猪 β-防御素 1(pBD-1)、猪β-防御素2(pBD-2)、猪β-防御素3(pBD-3)在梅山猪大部分的组织中表达水平高于杜长大猪，Qi等［39］研究发现 pBD-1、pBD-3 在藏猪组织表达水平也普遍高于杜长大猪。Ma等［40］研究显示cathelicidins家族抗菌肽PMAP-23、PMAP-37、PR-39和protegrin-1在民猪大多数组织中表达水平高于长白猪，且在胸腺、脾、肝、心脏组织中高表达，在回肠、空肠、舌头、淋巴结中低表达。

同时本课题组也研究了不同日龄金华猪和长白猪肠道β-防御素家族的表达规律，发现仔猪肠道pBD-1和pBD-3基因表达随日龄增加呈上升趋势，且20、40和60日龄金华猪肠道 pBD-1、pBD-2、pBD-3的表达水平均高于长白猪［41］。

4.2 外源致病因子对抗菌肽分泌表达的影响

抗菌肽是先天免疫重要效应分子，当外来细菌侵染的时候，机体分泌表达抗菌肽发挥相应的免疫调节作用。如小鼠感染K.pneumoniae后肠道CRAMP 表达显著增加［42］，Wu 等［43］报道鼠伤寒沙门氏菌能提高猪骨髓细胞PR-39和protegrin的基因和蛋白表达，Veldhuizen等［44］也发现鼠伤寒沙门氏菌能特异性地上调猪结肠上皮细胞系pBD-1和pBD-2的基因表达，而霍乱沙门氏菌则不能引起抗菌肽的表达变化。本课题组研究表明，大肠杆菌K88攻毒能提高金华猪和长白猪骨髓、脾脏、回肠中PR-39基因表达水平［37］。

4.3 抗菌肽的营养调控

通过营养手段调控内源抗菌肽的表达，是一种较为有效的方法，其中维生素D3和丁酸是最主要的手段。维生素D3可诱导多种细胞抗菌肽的表达［45-47］。此外，锌、多糖和益生菌等也发挥调控作用。 汪以真等［48］研究表明，硫酸锌(100 mg/kg)和纳米氧化锌(100 mg/kg)对猪PR-39的表达水平无显著影响，而高浓度氧化锌(3 000 mg/kg)能显著提高猪PR-39的表达水平(378.26%)。饲粮中添加细菌多糖能提高骨髓和肝脏中PR-39以及肝脏中Hepcidin的表达水平［49］。

其他学者研究表明，精氨酸和异亮氨酸等可以诱导人上皮细胞β-防御素的表达［50-52］，维生素A的代谢产物视黄酸可诱导猪PR-39的表达［43］。综上所述，以营养调控的方式促进内源抗菌肽的表达在目前更适合抗菌肽在畜牧生产中的应用，然而，这仍有赖于对抗菌肽表达调控机制更深入的研究。

5 抗菌肽的分子设计与改良

为了获得抗菌活性高、细胞毒性低、稳定性好的抗菌肽，将模板肽通过分子改良的方法被广泛应用。抗菌肽的分子改良主要依据其构效关系实施，这是设计抗菌肽所遵循的最基本原则。国内外普遍采用的改良方法主要包括:1)将2种不同源肽活性片段进行分子嵌合，形成杂合肽［53］;2)通过氨基酸替换，二硫键删除的方式将天然肽进行分子改造［54］;3)对天然肽截取活性片段以提高抗菌功能［55］;4)通过肽文库与计算机模拟进行高通量筛选［56］。

Liu等［57］采用分子杂合的方法构建了具有β发夹结构的杂合肽LB-PG和CA-PG，研究结果表明获得的杂合肽不仅安全性好，抗菌谱广，且具有缓解炎症的功能。此外通过氨基酸替换的方式对乳铁蛋白肽LFP-20进行改良，获得的改良肽LF-6具有更高的抗菌活性与低的真核细胞毒性。

另外Dong等［58］通过将天然抗菌肽截取的方式提高了禽β-防御素4的抗菌活性，同时降低了其溶血毒性;其还将具有广谱抗菌活性的RR7片段与抗细菌生物膜活性的FV7片段进行分子嵌合，获得兼具两者优势的杂合肽R-FV-I16［59］。

6 抗菌肽的重组表达

基因重组表达的方法可能是目前最经济的获得大量抗菌肽的手段。但是，由于抗菌肽极易受到蛋白酶的攻击，且表达产物往往对宿主细胞有毒性，因此，抗菌肽的外源表达较其他多肽类药物更为困难。为了克服以上难题，研究者探索出众多表达策略，涉及的表达系统主要有大肠杆菌和酵母表达系统。大肠杆菌表达系统具有遗传背景稳定、成本低、周期短的优点，但难以表达结构较为复杂的抗菌肽，而酵母表达系统虽然能够直接表达多种抗菌肽，但是其表达成本较高，产量较低。通过将目的肽与分子伴侣融合表达可有效解决抗菌肽对宿主菌的毒性以及易被蛋白水解酶降解的问题，常用的分子伴侣有硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)［60］、谷胱甘肽转移酶 (glutathione-S-transferase，GST)［61］、泛素相关小修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier，SUMO)［62］等。Bi等［63］在大肠杆菌BL21中融合表达了杂合肽LfcinB(1-15)-Melittin(5-12)，纯化后产量达到35 mg/L培养液，同时其利用毕赤酵母表达系统高产表达了鸟的防御素 Avian β-defensin 6，产 量 达 到 了114.9 mg/L培 养液［64］。Chen 等［65］利用SUMO融合表达技术在枯草芽孢杆菌表达系统中成功表达了天蚕素Cecropin AD，纯化后产量为30.6 mg/L培养液。Luan等［66］通过比较不同分子伴侣，不同诱导温度、时间等条件，利用SUMO融合表达技术在枯草芽孢杆菌表达系统中成功表达了蛇源抗菌肽C-BF。

7 小结与展望

在抗生素滥用导致耐药细菌产生、药物残留以及环境污染的今天，抗菌肽的研究无疑为解决这些问题带来了希望。然而，真正把抗菌肽应用于养殖业目前仍面临着许多挑战。首先是抗菌肽的来源问题，天然肽含量低，分离纯化困难，化学合成成本高，重组表达得率低。其次是抗菌肽的活性问题，与抗生素相比，杀菌能力偏弱，抗菌谱偏窄。而且不同肽在抗菌或免疫调节功能上各有侧重，不能统一标准。再次是抗菌肽的体内稳定性问题，对胃蛋白酶和胰蛋白酶的敏感让口服或饮水等给药方式受到限制，而对血清和金属离子的敏感亦让注射给药受到约束。另外还有抗菌肽的毒性问题，由于其在体内的吸收代谢机制不甚明了，其潜在的毒性如局部过敏反应、溶血作用等都不容忽视。最后是抗菌肽的耐药性问题，虽然其膜作用机制不存在抗生素样的耐药性，但由于应激反应触发的病原性免疫进化而导致的耐药性仍然存在。

随着抗菌肽研究的不断深入以及生物技术的发展，相信突破抗菌肽走向养殖业的技术壁垒将变为可能。通过构建合适的表达系统，完善表达策略将获得大量成本低、产量大、活性高的重组抗菌肽;通过基因改造、人工修饰等途径将最大限度地提升抗菌肽的抗菌功能;运用酰胺化、环化、D-氨基酸替代、包被等方法将提高抗菌肽在体内的稳定性和安全性;深入探讨抗菌肽的药代动力学将进一步挖掘抗菌肽在体内发挥作用的机制，以上研究将会为研发高效安全的抗菌肽制剂提供重要基础。

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