流感的局部治疗和预防

李秀景，尹俭俭，郑丛龙，丁 宁

(1.大连大学 医学院 病原生物学教研室，辽宁 大连116622;2.邹平县中医院 检验科，山东 邹平256200)

流感病毒属于正黏病毒科，是单负链RNA 病毒，通过呼吸道传播，曾多次引起全球流感大流行，每次流行都造成了严重的人力和物力的损失［1-2］。据世界卫生组织报道:每年流感全球流行可引起300 ～500 万人发病，导致2 ～5 万人死亡［3］，受到流感感染的人口约20% ～40%，且流感导致的死亡率也在增加［4］。2009年3月在墨西哥暴发的甲型H1N1 流感，传播迅速，世界卫生组织于2009年6月11日便将全球流感疫情警戒等级提高到了第六级。2013年3月在中国暴发的H7N9 禽流感，截至5月30日有132 人感染，33 人死亡。目前，临床上常用的流感的治疗和预防方法是药物治疗和接种疫苗，药物多为口服药，疫苗的接种多为肌肉注射。流感病毒的感染和病毒的复制主要发生在上呼吸道上皮细胞，病毒一般不入血，但常引起机体局部的炎症反应和全身性反应［5］。局部治疗和预防可以利用呼吸道黏膜的免疫作用，对病毒的感染和复制起到一定的抑制作用，减轻局部炎症反应。呼吸道黏膜不仅是呼吸道病毒入侵机体的主要门户，也是机体防御病毒感染的重要部位。覆盖着一层假复层纤毛柱状上皮细胞，纤毛不停的摆动，具有机械的屏障作用，呼吸道黏膜上皮的杯状细胞和粘液腺的上皮细胞能分泌粘液，通过纤毛活动和上皮细胞分泌的粘液可以阻挡和排除外界有害的刺激因子。呼吸道黏膜部位有游走的或固定的吞噬细胞，其能够吞噬病原微生物;且黏膜下层丰富的淋巴网能够阻留和破坏病原微生物。正常人的呼吸道黏膜上皮细胞由于接受某些病毒的隐性感染，常含有一定量的干扰素，可对病毒发生干扰作用。因此，流感病毒的局部治疗和预防即呼吸道黏膜给药的用药方法可以作为今后抗流感研究的一个重要方向，如鼻腔给药，其使用方便，可随时自行给药，患者依从性好［6］。

1 流感的局部治疗

1.1 流感治疗现状

流感病毒一旦进入和定植于呼吸道上皮，经吞饮作用，黏附和穿入柱状上皮细胞，并在细胞内进行复制。持续4 ～6 h，新的病毒粒子从细胞膜上芽生，借神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的作用而释放，再感染邻近的柱状上皮细胞，短期内致大量呼吸道上皮细胞受染，受染细胞发生坏死、脱落及局部炎症反应。目前，临床上常用的流感的治疗方法是药物治疗，常用药有干扰病毒M2 蛋白功能的药物即离子通道抑制剂，其代表药为金刚烷胺和金刚乙胺，以及神经氨酸酶抑制剂，其代表药为奥司他韦和扎那米韦。金刚烷胺和金刚乙胺作用靶点为M2 蛋白四聚体形成的离子通道，通过阻碍H+流向病毒粒子内部，使病毒粒子内部pH 值居高不下，从而阻碍病毒血凝素(hemagglutinin，HA)构象的改变，使HA1和HA2 不能分离，阻碍了病毒膜和内体膜的融合，使病毒脱衣壳受阻。奥司他韦和扎那米韦通过与流感病毒NA 的酶活性点的保守残基段的不同部位特异性结合，从而造成酶活性丧失，使依附在糖蛋白和糖脂上的末端唾液酸不能裂解，从而导致流感病毒子代毒粒不能从感染细胞表面释放和阻断了病毒的播散［7-8］。由于单链RNA 病毒缺乏自我校正的机制，在药物的作用下，其突变频率会明显增高［10］，对药物产生耐药性，2008—2009年在美国几乎100%的季节性H1N1 病毒对奥司他韦具有了耐药性，以及几乎所有的H3N2 病毒对金刚烷胺也产生了耐药性［10］。2010年8月，WHO 报告的全球15 000 个甲型H1N1 流感临床标本中，312 个对磷酸奥司他韦耐药，未发现对扎那米韦耐药的病毒株在流行传播［11］，但在其作用下迟早会产生耐药基因的突变。随着甲型H1N1 流感的蔓延以及甲型H1N1 流感病毒对达菲耐药的出现，安全、有效的流感治疗药物和治疗方法的研究显得尤为重要。

1.2 流感局部治疗的研究

流感病毒主要吸附纤毛上皮细胞以及含α -2，6 半乳糖苷唾液酸丰富的气管和支气管上皮细胞，若将药物经局部给药直接作用于纤毛上皮细胞以及气管和支气管上皮细胞，从而减少流感病毒的传播。现在研究比较多的黏膜给药的药物有干扰素、纳米金属和一些中药。

干扰素是一种可以抑制病毒复制的细胞因子，其作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生化过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，从而实现对病毒的抑制作用。临床上常用干扰素的剂型多为肌肉或静脉注射给药，但其对病毒引起的局部皮肤或黏膜感染的体内半衰期短，增加其给药量会对机体产生较大的副作用。马天舒等［12］研究表明，rhIFN α-2b 滴鼻剂能增强小鼠的NK 细胞的活性，刺激机体产生分泌型IgA 的含量升高，显著提高机体的免疫力。因此，干扰素的局部给药对流感的治疗具有现实意义。王蓉等［13］用小剂量干扰素经口腔喷洒给药作用于小鼠，证实小剂量干扰素口腔局部给药能够预防和治疗流感病毒的感染;蒋为民等［14］证实重组IFN α -2b 含片经口腔黏膜给药15 d 时，明显降低流感病毒所致的小鼠死亡率，并明显延长其存活时间，并且肺部病变程度明显减轻。杭州中心血站成功试制了人白细胞干扰素滴鼻剂并通过了鉴定，其对流感治疗的显效率为47.8%，总有效率为89.4%。黄宇等［15］研究证实:重组人干扰素α -2a 滴鼻剂在100 万IU/mL 及其以上浓度对小鼠流感病毒性肺炎有明显的治疗作用。

纳米医学研究在生物医疗领域具有广阔的应用前景，国内外关于纳米银在抗菌作用方面的研究报道很多。目前，Fujimori Y 等［16］研究发现，纳米碘化铜粒子溶于水溶液经鼻腔给药后对2009年的H1N1甲型流感病毒具有抗病毒活性;并且纳米碘化铜粒子的抗流感病毒活性呈剂量依赖性。电子自旋共振光谱分析显示纳米碘化铜粒子在水溶液中能够产生羟自由基，从而起到抗病毒活性;SDS -PAGE 分析证实，纳米碘化铜颗粒能够降解流感病毒表面的血凝素和神经氨酸酶使病毒失活。

2 流感的局部预防

2.1 流感的预防现状

接种疫苗是预防和控制流感的最有效的策略，接种疫苗可以降低流感病毒所导致的病人的发病率和死亡率［17］。目前应用的流感疫苗有3 种［18］:(1)全病毒疫苗，是由完整的流感病毒颗粒组成的，其包含表面抗原和内部抗原，具有良好的免疫原性，其反应原性也较强;但病毒包膜中的类脂质属于致热原，常常引起发热反应。(2)裂解病毒疫苗，是用裂解剂将流感病毒裂解、纯化后制成的;该疫苗去除了病毒核酸和大分子蛋白，但保留了血凝素和神经氨酸酶以及部分基质M 蛋白和核蛋白;与全病毒疫苗相比，其免疫原性和安全性均较好，目前被广泛使用于国内外。(3)亚单位疫苗，是流感病毒经裂解和进一步纯化后获得的仅含血凝素和神经氨酸酶的疫苗，其安全、有效以及不良反应少。虽然流感病毒疫苗具有保护流感病毒肺部感染的作用，但其效果与情绪及机体的机能状况有密切的关系，当机体状态不佳时，使产生的抗体和杀伤T 淋巴细胞减少，而且在接种疫苗的14 d 内对机体无保护作用［19-21］。流感病毒的聚合酶具有错配的倾向，导致血凝素或神经氨糖酸苷酶的基因突变不断累积，HA 蛋白的抗原变异会改变人类对流感病毒的易感性，造成抗体的针对性变弱。灭活疫苗的生产效率低，一旦流感开始流行，其特异性的流感病毒疫苗的生产不能够满足急切的全球需求量。因此，流感的预防面临着重大的挑战。

2.2 流感局部预防的研究

目前，流感病毒的局部预防研究比较多的是经鼻腔给予乳酸菌和经鼻腔接种疫苗。Youn HN等［22］，经鼻腔给药给予每只小鼠107和108cfu 的活性乳酸菌，连续滴鼻21 d 后，用流感病毒感染小鼠，结果显示，其能够明显提高流感小鼠的存活率;取其肺脏测得IgA 和白细胞介素-12 的含量增加，从而起到抗流感的作用。后来Youn HN 等［23］又研究发现经鼻腔给予每只小鸡500 μL 的1.5 ×109cfu 发酵乳酸菌CJL-112，连续给予7 d，用H9N2 流感病毒感染小鸡，然后将这些感染了流感病毒的小鸡与正常小鸡一起圈养，发现与其一起圈养的正常小鸡的胃肠道脱落物和呼吸道脱落物的病毒含量均降低，说明发酵乳酸菌CJL -112 能够降低流感病毒的传播。Izumo T 等［24］鼻腔给予BALB/c 小鼠戊糖乳酸杆菌S - PT84，1 次/d，连续给药3 d，用流感病毒PR8 感染小鼠，其存活率随着S -PT84 剂量的增加而增高，并且其鼠肺灌洗液中病毒滴度与对照组相比降低;S - PT84 滴鼻组鼠肺灌洗液中白细胞介素-12 和干扰素-α 的水平显著提高，并且其肺中的自然杀伤细胞的活性显著增强。Harata G 等［25］给BALB/c 小鼠滴鼻鼠李糖乳酸菌GG(LGG)3 d，然后用流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)感染小鼠，LGG 组小鼠与对照组小鼠相比，其出现流感症状的频率减低，生存率增高;并且LGG 组小鼠的白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子和单核细胞趋化蛋白-1的mRNA 的表达量明显增多。

目前经鼻腔进行疫苗接种已成为研究的热点，Illum 等［26］成功研制了白喉疫苗粉剂，然后将白喉疫苗普通粉剂和白喉疫苗壳聚糖粉剂分别鼻腔给药与传统的白喉疫苗接种进行比较，壳聚糖组更加安全、有效，并能诱发细胞免疫。Esposito S 等［27］研究发现与传统的三价灭活疫苗相比，活性减弱的流感疫苗鼻腔接种能够增强其在小孩和老年人体内的免疫原性，其对小孩和青少年的免疫效率明显增高。由于疫苗接种后免疫原性较弱，现在研究中多添加佐剂。Kang H 等［28］将灭活的H9N2 辅以佐剂CpG DNA 和胆酸钠鼻腔接种于10日龄的鸭子，其能增强鸭子是局部免疫反应和全身免疫反应，经鼻腔接种的鸭子的咽喉、气管和血清中的特异性IgA 和IgG 抗体水平，并且增加了气管和肺中的白细胞介素-2 和白细胞介素-6，增强了其对流感的预防作用。

3 展 望

流感病毒经呼吸道传播，能够引起严重的呼吸道疾病，有时甚至导致死亡。因其变异快，控制其危害仍是医学界的一项艰巨的任务。由于流感病毒主要吸附于纤毛上皮细胞以及含α -2，6 半乳糖苷唾液酸丰富的气管和支气管上皮细胞上，一般不入血，所以呼吸道上皮细胞是其复制和增殖的主要场所。有研究显示，重组合成的唾液酸融合蛋白DAS181，作用于细胞表面的唾液酸抑制流感病毒的感染，从而有效地预防和治疗流感［29］。有研究证实，人呼吸道胰蛋白酶活性蛋白酶(HAT)和跨膜蛋白酶丝氨酸S1 -2(TMPRSS2)在细胞表面和细胞内能够抑制HA 的分裂，从而阻碍流感病毒的复制［30］。目前，治疗流感的药物多为口服药，存在肝脏首过效应，使药物的生物利用度减低。局部给药如鼻腔给药，克服了这些缺点，而且使用方便，患者依从性好，起效速度快。因此，流感的局部治疗和预防将成为流感研究中的重要方向。

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