新型隐球菌生态学和种群结构研究进展

陶星辰，刘晓英，刘硕然，苏鸿雁*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000;2.大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

新型隐球菌生态学和种群结构研究进展

陶星辰1，刘晓英1，刘硕然2，苏鸿雁2*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000;2.大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

新型隐球菌是广泛存在于环境中的病原真菌，其流行病学与各个变种的生态学密切相关。近年来，隐球菌病的发病率越来越高，所以研究自然环境中新型隐球菌各个变种的生态学、种群结构以及季节性流行变化，对及时有效地预防和控制隐球菌病的发生与传播有着重要意义。对国内外自然环境中新型隐球菌各个变种的生态学、种群结构以及季节性的流行变化的研究概况及研究成果进行了概述。

新型隐球菌；生态学；种群结构；季节性变化

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）属于担子菌门Basidiomycota、银耳纲Tremenomycetes、银耳目Tremellales、银耳科Tremellaceae、隐球菌属Cryptococcus，为酵母样真菌，其属名源于希腊语“kryptos”，意为隐藏的意思，即不能产生内生孢子〔1〕。该菌于1894年被确认为是一种人的致病菌，是由Otto Busse、Hora⁃ham Buschke和Sanfelice分别从人体和桃汁中分离出来并予报道的〔2〕。目前将新型隐球菌分为3个变种，即格鲁比变种Cryptococcus neoformans var.grubii，新生变种Cryptococcus neoformans var.neoformans和格特变种Cryptococcus neoformans var.gattii。根据新型隐球菌细胞外荚膜多糖的抗原性差异，将新型隐球菌分为A、B、C、D和AD 5种血清型〔3〕。这种分类法成为新型隐球菌经典的分类法，为分类学研究、流行病学研究和毒力因子研究奠定了基础。新型隐球菌属于环境来源的病原真菌，其流行病学和各个变种的生态学密切相关。目前我国尚未对不同地理环境下新型隐球菌进行系统调查研究，故对环境中新型隐球菌变种的研究进行概述。

1 新生隐球菌

在20世纪70年代中期，Kwon-Chung等〔4〕将新型隐球菌分为两类：新生变种（血清型A、D和AD型）和格特变种（血清型B和C）。到了20世纪90年代末期，Franzot等通过对URA5基因的核苷酸序列分析研究发现，血清型A菌株的URA5基因的核苷酸序列平均相差（3.0±1.7）bp，而血清型D菌株的URA5基因核苷酸序列平均相差（7.2±3.4）bp，血清型A与血清型D之间碱基差异为（41.9±2.7）bp，通过系统发育图也可发现血清型A和血清型D是两个完全不同的群组；因此Franzot等承认这些遗传差异以及之前报道的表型差异，将血清型A从新生变种中分离出来形成一个新的变种即格鲁比变种〔5〕。

1.1新生隐球菌生态学新生隐球菌血清型A在全世界广泛分布，而血清型D则主要分布在欧洲地区〔6〕。它们与鸟粪之间存在着某种联系，尤其是鸽粪〔7〕。在自然界中，鸟类的体内平均温度达42.5℃，而该温度会抑制隐球菌生长，鸽子很少感染隐球菌，Swinne-Desgain等〔6〕研究发现鸽子的喙、爪子和羽毛也可以作为新生隐球菌的传播媒介。新鲜鸽粪中高浓度的氨也会抑制其生长，相比之下，暴露于空气中的干燥鸽粪中会比较容易分离到新生隐球菌。干燥鸽粪为新生隐球菌提供了一个天然的优良生长环境，在此环境中，新生隐球菌可以分解代谢高浓度的尿素、儿茶酚胺和其它含氮化合物，为其生长提供能量〔8〕。近年来，不断有新生隐球菌从世界各地不同树种中分离出的报道，包括在阿根廷、哥伦比亚、巴西、印度、南非和泰国。同样有报道，新生隐球菌也可以从蝙蝠洞、腐烂的蔬菜、水果、昆虫、乳制品和土壤中分离，但无论是阳性率还是生物量都远低于鸽粪标本〔6〕。

1.2新型隐球菌新生变种种群结构（血清型D）由于对新型隐球菌血清型D（VNⅣ）的研究相对较少，继而与它们种群相关的信息十分有限。通过MLEE技术对新型隐球菌新生变种遗传多样性进行初步探索，并且从6株地理分布不同的血清型D菌株之间鉴定出5种基因型〔9〕。随后的研究中，使用不同的遗传标记和不同来源的菌株，在血清型D菌株种群内并没有发现基因重组〔10〕。

虽然无性繁殖是新生隐球菌主要的繁殖形式，但是AD杂合菌株的出现表明新生隐球菌种群之间可以发生重组。在临床与环境中的血清型A和D菌株中，MATɑ和a型菌株数的比例为40:1，显示出MATɑ型所处的明显优势地位〔10〕。AD杂合菌株交配型等位基因比例相对均衡，因为大多数杂合菌株具有两种交配型等位基因，在杂合过程中，其中一些从血清型D菌株中获得MATa和从血清型A菌株中获得MATɑ，而另外一些则从血清型D菌株中获得MATɑ和从血清型A菌株中获得MATa；在对两个多态核基因序列分析中发现，14株AD杂合菌株的每个位点含有不同的等位基因；一个等位基因类似于血清型A菌株，另一个则类似于血清型D菌株。由于血清型D菌株样本数量较少，因此血清型D菌株种群结构与地理区域分布的关系并没有被系统研究〔6〕。

1.3新型隐球菌格鲁比变种种群结构（血清型A）全世界90%以上的隐球菌病是由新型隐球菌格鲁比变种引起的。该变种广泛存在于环境中，如今已成功地从土壤、腐烂的树木以及鸟类粪便中分离得到，以陈旧的鸽粪最常见〔11〕，其种群结构和分子流行病学已经得到广泛研究。早期，多位学者通过RFLP〔12〕、多位点酶电泳〔13〕和PCR指纹技术〔14〕对血清型A菌株进行分子流行病学方面的研究，研究发现血清型A菌株种群之间具有较低的遗传多样性。此研究结果后来被Jianping Xu等〔6〕所证实，他分析了314株血清型A菌株的3个基因位点和一个线粒体基因座，在全球种群抽样中未发现地理区域分布的差异性。Boekhout等人〔15〕选用来自13个国家的96株临床和环境菌株，通过AFLP基因分型并分析遗传多样性，也得到了类似的结果。同样，Lit⁃vintseva等〔16〕在美国利用AFLP技术对临床和环境中血清型A菌株进行基因分型并分析它们的遗传多样性，结果发现血清型A菌株种群之间具极低水平的遗传变异性。此外，早期的研究表明，无论是在环境中还是临床上，拥有等位基因MATɑ血清型A菌株都占主导地位〔17〕。

全球血清型A菌株的种群包括3个亚群：VNⅠ、VNⅡ和VNB。VNⅠ和VNⅡ世界范围内广泛分布，而VNB仅分布于非洲〔18〕。AFLP和DNA指纹技术用于VNⅠ和VNⅡ亚种群分布的研究。VNⅠ分布广泛，具较低的遗传多样性，VNⅡ相对罕见且主要从临床标本中分离得到。2003年，在博茨瓦纳发现不寻常的血清型A临床菌株之后，学术界对格鲁比变种种群结构的认识发生改变，格鲁比变种种群可以发生高度遗传变异，MATa交配型在实验条件下能够发生配对和重组〔19〕。先前认为MATa交配型菌株已经灭绝，但在2000年〔20〕和2001年〔21〕，MATa交配型菌株首次被报道仍然存在。在随后的调查研究中，通过MLST方法对博茨瓦纳格鲁比变种种群进行基因分型，结果发现博茨瓦纳格鲁比变种种群非常多样化且多数分布在非洲南部〔18〕。Bovers等〔8〕对117株新生隐球菌和格特隐球菌的6个基因位点进行系统发育分析，证实血清型A的3个基因型确实存在，且发现VNB菌株不完全局限于非洲南部。Ngamskulrungroj等〔22〕通过MLST研究同样也发现少数VNB菌株分布在美国南部地区，来自其他地域VNB菌株间的遗传多样性显著低于非洲VNB菌株，另外，在不是非洲来源的VNB菌株中未发现交配型等位基因MATɑ。总体而言，目前的数据表明，虽然少数VNB菌株可分布在非洲以外地区，但大多数VNB菌株仍局限于撒哈拉以南地区，主要从非洲可乐豆树Colophospermum mopane的腐洞中分离获得〔6〕。

Jianghan Chen等〔23〕通过MLST技术对中国大陆16省的120株新生隐球菌（血清型A，MATɑ）研究发现，中国新生隐球菌是区别于VNⅠ标准菌株的一个亚群VNⅠc，VNⅠc世界性分布并非中国独有。VNⅠc是否是最常见的基因型尚不清楚，因为目前在中国只研究分析了临床菌株，Jianghan Chen等〔23〕认为环境中新生隐球菌的分离及分子分型将会对中国VNⅠc与健康人群之间感染关系的研究提供重要数据。

2 新型隐球菌格特变种（血清型B和血清型C）

新型隐球菌格特变种通过分子指纹技术（mo⁃lecular fngerprinting）和基因系谱（gene genealogical analyses）分析将其分为4个基因型：VGⅠ、VGⅡ、VGⅢ和VGⅣ〔24〕。

2.1新型隐球菌格特变种生态学环境抽样分析表明4种基因型与腐木、树皮及土壤关系密切，尤其是桉树。1990年Ellis等报告由澳洲赤桉Eucalyptus camalduensis分离出新型隐球菌格特变种，并提出该变种的临床感染病例分布与该植物的地理分布一致的观点〔25〕。然而，尚未清楚桉树中格特变种高阳性率是与桉树本身有关，还是实验偏差。最初格特变种采样主要集中于三大洲，即澳洲、亚洲、北美，采样植物主要是赤桉及其他桉树品种；以往的文献研究表明，桉树作为采样标本的频率远远高于其他植物品种。其实，格特变种同样也分布于其他树种中。在印度，格特变种可从当地树木中，如印度楝Azadirachta indica、罗晃子Tamarindus indica、芒果树Mangifera indica、阎浮树Syzygium cumini等中分离出；在南美，在扁桃树Terminalia catappa中分离获得格特变种；在北美，温哥华岛上的花旗松Pseu⁃dotsuga menziesii、桤木Alnus rubra及西北太平洋地区其他的树木都可以分离出格特变种〔6〕。

我国从澳洲引进赤桉历史久、地域广，从17°～33°N均有大片的赤桉种植区，如江西、广西、广东等地区，李安生和吴绍熙等人选择在6月份和11月份两次采集该树树叶、树皮、花和花蕊、腐败木质和土壤等标本819个，接种于1 600多个CACA平皿，结果未分离到格特变种，李安生和吴绍熙等认为可能和该树种在我国自然环境下生长之后发生适应性变化，和自然生长环境因子有关，此外，也可能与该地区引种的赤桉系由种子培育而成，原始携带的隐球菌孢子量相对较少也有一定的关系〔26〕。

2.2新型隐球菌格特变种种群结构目前，大多数新型隐球菌变种系统地理学研究应用的是来自不同基因型的组合数据，并不能为每个基因型的多样性评估提供充分有效的解决方案〔10〕。Kidd等〔24〕对新型隐球菌格特变种做了全面的系统学分析，解决了评估遗传多样性和全球VGⅡ基因型种群结构这一世界性课题。在这项研究中，Kidd等〔24〕分析了来自不同地理区域的VGⅠ和VGⅡ基因型的4个基因位点，但未发现种群间的地理隔离。另外，他们观察到菌株之间的差异和地理距离之间没有相关性。同样，Fraser等〔27〕采用多位点遗传分析方法对新型隐球菌格特变种种群遗传多样性进行分析，得出相同的结果。

研究结果表明，温哥华持续爆发的隐球菌病与VGⅡ基因型密切相关，主要是VGⅡa和VGⅡb亚型，且已经蔓延到不列颠哥伦比亚省〔10〕。VGⅡa亚型主要分布在太平洋西北地区。在2008年和2009年，从俄勒冈的动物体内和临床中发现了一个新的基因亚型VGⅡc〔28〕。

总而言之，综合地理采样和更精准的遗传分析相结合的分析方法，将提高人们对新型隐球菌格特变种的全球种群结构和起源的理解〔6〕。

3 新型隐球菌季节性流行变化

近年来印度学者Randhawa H.S.研究了印度西北地区，在不同树种腐洞中格鲁比变种和格特隐球菌流行的季节变化。研究发现，格鲁比变种和格特隐球菌在秋季的分离率是最高的，其次是在夏季。对于格特隐球菌而言，其在冬季的流行率是最低的，而格鲁比变种最低的流行率则发生在雨季。同样，在泰国北方地区对鸡粪中新型隐球菌的一项调查研究中，也出现了相同的结果〔29〕。Granados等〔30〕做了一项回顾性的研究，他们在哥伦比亚的4个城市研究分析了树样中不同种类的新型隐球菌的流行率与气候条件的关系，发现格鲁比变种比格特隐球菌更耐热，但过多的水分不利于其生长。1992年至2004年期间，Kidd等〔31〕在哥伦比亚的4个城市做了一项关于在一定气候条件下树样中不同血清型的新型隐球菌分离率的回顾性研究，研究发现在阳性的样本中，56.5%是血清型B，24.7%是血清型C，18.8%是血清型A，结果表明环境气候条件主要是湿度、温度和太阳辐射会通过不同方式影响树木中不同血清型的新型隐球菌的流行率。2007年，Kidd等〔32〕在加拿大的不列颠哥伦比亚和美国西北部地区的一份环境调研报告中指出，在温和、干燥和较低的相对湿度的夏季（5～8月份）格特隐球菌的菌落的群体密度显著高于寒冷、潮湿和较高的相对湿度的月份。目前我国已有报道格特变种感染的临床病例，然而国内尚缺乏对种植的澳洲赤桉分离到该变种的报道〔25〕，也未有新型隐球菌季节性流行变化研究的相关报道。

4 展望

近几十年来，侵袭性真菌感染的发病率在全球范围内呈现出持续上升趋势，已成为住院患者致死病残的主要威胁之一，隐球菌是遍布大自然界的一种担子菌病原体，是全球最常见的中枢神经系统（CNS）感染病原体之一。随着国外对自然环境中新型隐球菌研究的深入，国内新生隐球菌和格特隐球菌的生态学研究、种群结构研究和季节性流行变化成为重要的流行病学研究课题，加强对新型隐球菌生态学和种群结构的研究是我们所要面临的任务。

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*通信作者：苏鸿雁，教授.

（责任编辑 毛本勇）

Progresses and Perspectives of Ecology and Population Structure ofCryptococcus neoformans

TAO Xingchen1,LIU Xiaoying1,LIU Shuoran2,SU Hongyan2*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Agriculture and Biology Science,Dali University, Dali,Yunnan 671003,China）

Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungi which is widely spread in the environment,and its epidemiology is closely related to the ecology of the various variants.In recent years,with the gradual increasing of cryptococcosis incidence,the study of ecol⁃ogy of its various variants,population structure in natural environment and changes in seasonal epidemics has great significance for ef⁃fective prevention and control of the occurrence and transmission of cryptococcosis.This paper reviews the advancements in the study of ecology,population structure in natural environment and changes in seasonal epidemics of Cryptococcus neoformans at domestic and abroad.

Cryptococcus neoformans;ecology;population structure;seasonal change

R379.5

A

1672-2345（2014）06-0066-05

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.06.017

国家自然科学基金资助项目（31060019；31100093）；云南省教育厅重大专项资助项目（ZD2010010）；云南省中青年学术带头人资助项目（2012HB-042）

2013-12-08

2013-12-18

陶星辰，硕士研究生，主要从事微生物及微生物疾病研究.