锌对SD大鼠膝骨关节炎早中期关节软骨的作用及对MMP-13表达的影响

谭力铭 ,仇成凤 ,李 峰 ,刘 洪 ,罗顺红 ,邓紫薇 ,王宏强 ,雷礼辉

(1.怀化市第一人民医院临床药学研究室,湖南怀化418000;2.怀化市第一人民医院骨科)

骨关节炎(osteoarthristis,OA)是一种严重危害中老年人健康的慢性退变性关节疾病。其致病因素非常复杂,被认为是年龄、遗传、机械损伤、生物等多种因素导致的一种长期、慢性、渐进的病理过程,其中,关节软骨的退行性改变是OA发病的病理基础和核心[1-2]。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成,几乎所有的致病因素均是通过影响这二者而致病[3-5]。基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)通过降解细胞外基质而启动了OA的早期病变过程[6],因此,被认为是OA致病因素中的一类关键介质,其中MMP-13,又称胶原酶-3,是唯一能够裂解胶原分子中三维螺旋的酶,主要降解占细胞外基质95%的Ⅱ型胶原。MMP-13具有5个功能不同的结构域,以酶原形式分泌,受蛋白酶或其它因子激活,其催化活动区有Zn2+结合位点,是一个Zn2+、Ca2+依赖的蛋白水解酶[7-9]。本研究通过改良Hult法[10]建立SD大鼠OA模型,探讨给予不同剂量的锌对OA软骨的作用及对MMP-13表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型复制

健康雄性SD大鼠64只,由南华大学实验动物中心提供,批号 SCXK(湘)2010-0004,体质量180±10 g,随机分为对照组、低锌组、中锌组和高锌组4组。适应饲养1周后,行改良Hulth法复制膝骨关节炎模型:手术前肌肉注射青霉素40万U/只,切断右膝关节前后交叉韧带、内侧副韧带和内侧半月板,止血并关闭伤口,肌肉注射青霉素40万U/只。术后不固定患肢,置于标准动物饲养笼中允许其自由活动及进食;驱赶强迫运动1周,每周上午与下午各15 min。

1.2 给药方法

行造模术后第2天,每只大鼠按体质量灌胃给药,2次/天,低锌组给予硫酸锌每天5 mg/kg,中锌组每天10 mg/kg,高锌组每天20 mg/kg,对照组给予等剂量生理盐水灌胃。分别于术后4周、8周分组处理,每次每组8只。

1.3 标本采集和处理

每只动物行深度麻醉处死后,立即解剖右膝关节,分离周围组织,暴露右膝股骨内侧髁,切下股骨髁置于4%多聚甲醛中固定,15%EDTA-2Na溶液脱钙,石蜡包埋,分别切片,行HE染色、MMP-13免疫组化染色。

1.4 HE染色

石蜡切片5 μm脱蜡后染色,苏木素染色3 min,水洗,0.5%盐酸酒精分化30 s,水洗,伊红染色1 min,再水洗,快速过梯度酒精脱水,晾干后中性树胶封片。细胞核蓝紫色,胞浆、间质红色(苏木素-伊红染色液,XW-RS-001,上海沪峰生物科技有限公司)。

1.5 免疫组织化学

石蜡切片3 μm连续切片;60℃ ～65℃烤片4 h;进行脱蜡、水化,采用高压抗原修复方式对切片进行抗原修复;每张切片加50 μL过氧化物酶阻断液,室温下孵育10 min;每张切片加50 μL非免疫性动物血清,室温下孵育10 min;甩去血清,每张切片加50 μL第一抗体(MMP13,兔抗 ab39012稀释度1∶200),4℃过夜;按照免疫组化试剂盒(KIT-0305,羊抗鼠/兔,迈新生物)操作;每张切片加1～2滴新鲜配制的DAB(DAB显色试剂,产品编号Cat.No:DAB-0031/1031),显微镜下观察3～10 min,阳性显色为棕色或黄色;苏木素复染,切片经过梯度酒精脱水干燥,中性树胶封固。胞膜、胞浆、胞核染色,为棕色信号。

1.6 观察指标

光镜下对HE染色标本行组织形态学观察;应用双盲法参照Mankin评分标准[11](见表1)对HE切片进行评分;术后8周MMP-13免疫组化染色切片用Motic Fluo 1.0测定其灰度值进行半定量分析。

表1 骨性关节炎组织病理学分级评分Mankin表(总分14分)

1.7 统计学分析

采用SPSS17.0进行统计学分析。全部数据以用±s表示,one-way ANOVA方法对组间差异进行比较,P＜0.05为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 关节软骨HE染色组织形态学观察

从图1可见,术后4周,对照组健侧大部分为正常关节软骨组织,HE染色基质着色均匀,无失染;软骨细胞核呈深蓝色,细胞层次清楚,排列整齐,大小均一。其余4组(对照组术侧、低锌组术侧、中锌组术侧和高锌组术侧)软骨损伤均出现轻度损伤,软骨表层不平整,无裂隙,细胞数或增多,或稍减少,基质染色轻度减少;基质染色轻染,有不均现象,但4组之间的软骨损伤程度无明显差异。

术后8周,对照组健侧与术后4周时没有区别,均为正常软骨组织。对照组术侧、低锌组术侧和中锌组术侧的软骨损伤程度较术后4周时加重,为中度软骨损伤,软骨表面不规则,有些出现裂隙,细胞排列紊乱;簇集软骨细胞出现频率增加,或细胞数减少;基质染色不均甚至出现重度减少;潮线不规则,潮线完整性受到破坏。高锌组术侧软骨组织为轻度软骨损伤,无裂隙出现,软骨细胞数稍减少,基质染色轻染。

图1 关节软骨HE染色组织形态学观察(×200)

2.2 HE切片Mankin评分

从表2可见,术后对照组4周和8周Mankin评分术侧明显高于健侧(P＜0.05),术手8周,高锌组术侧Mankin评分明显低于对照组术侧(P＜0.05)。

表2 各组标本Mankin评分结果

2.3 关节软骨MMP-13免疫组化观察

从图2和图3可见,对照组健侧的标本中MMP-13的含量较少,对照组术侧、低锌组术侧和中锌组术侧3组中的MMP-13含量较多,免疫组化切片中可见大量染成棕褐色的阳性细胞,高锌组术侧标本中的MMP-13含量较对照组术侧少,两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨 论

本研究以雄性适龄SD大鼠作为实验动物,采用改良Hulth法复制OA模型。改良Hulth法与传统Hulth法比较,具有出血少、术后应激反应轻、对实验过程影响小等优点。在预实验过程中发现,雄性SD大鼠较之于雌性SD大鼠更适合复制OA模型,雄性SD大鼠具有抗感染强、对麻醉药品的耐受性稳定、术后存活率高等优点,而且与利用新西兰大白兔作为实验动物比较,其成本低,喂养方便。因此,雄性SD大鼠是较为理想的一种复制OA模型的实验动物。

图2 术后8周各组MMP-13免疫组化结果(×400)

图3 术后8周各组MMP-13免疫组化灰度图 与对照组健侧比较,#:P＜0.05;与对照组术侧比较,*:P＜0.05

锌是体内一种重要的微量元素,参与机体多种生物化学反应,其具有调节免疫、促进伤口愈合、维护生物膜结构与功能的稳定以及抗氧化等作用。锌用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)早有研究并已在临床上使用[12-13]。OA的发病机制虽然不同于RA,但其具有共同的病理改变如滑膜炎症及软骨破坏。同时,引起OA软骨组织细胞外基质主要成分Ⅱ型胶原降解的重要酶MMP-13,是一种锌离子依赖的水解酶。本研究通过SD大鼠整体动物模型探讨锌对OA软骨的作用及对MMP-13表达的影响。

本实验结果发现,在造模术后第2天,除对照组外,其它各组分组分别给予不同剂量的锌干预后4周,取膝关节软骨组织行HE染色光镜下观察组织形态学变化并Mankin评分,结果显示造模成功。低锌组术侧、中锌组术侧与高锌组术侧与对照组术侧比较无统计学意义,说明在给予锌4周后,锌对OA软骨作用不明显。在继续分组给药干预后8周发现,高锌组术侧与对照组术侧比较,光镜下HE染色切片观察,高锌组术侧的标本软骨组织损伤轻于对照组术侧,两组Mankin评分结果比较具有统计学意义;MMP-13免疫组化切片比较,高锌组术侧标本中MMP-13阳性细胞数少,其灰度值低,两者比较具有统计学意义。而低锌组、中低组与对照组术侧比较,其软骨损伤未有明显差异,Mankin评分与MMP-13免疫组化切片灰度值比较均无统计学意义。以上研究表明,高剂量锌(每天20 mg/kg)连续给予8周后,可以明显减轻SD大鼠OA软骨损伤,可以减少MMP-13的表达。

早期研究与本次实验结果表明,锌对OA软骨的作用不是单一的。王声雨等[14]对骨性关节炎患者滑膜组织中16种元素分析发现,骨性关节炎组滑膜组织中的Zn2+含量较正常组升高。MMPs包括MMP-13是OA病变发生发展过程中重要的蛋白酶家族,因其需要Zn2+等辅助因子而得名,其催化活性区有锌离子结合位点,对酶的催化作用至关重要。因此,在没有体外锌干预的情况下,骨性关节炎组滑膜组织中的Zn2+含量要高于正常的关节滑膜组织可能与MMP-13的活化需要锌有关。本研究在分别给予不同剂量、不同时间的锌治疗后,发现高剂量连续治疗8周后,可以明显减轻OA软骨损伤,且减少MMP-13的表达,这些表明,锌是通过多种途径作用OA软骨,其机制有待进一步阐明,在接下来的实验中,进一步探明高剂量锌对OA软骨的保护机制将是我们的研究重点。

[1]Van den Berg WB.Osteoarthritis year 2010 in review:pathomechanisms[J].Ost Cart,2011,19(4):338-341.

[2]Martel-Pelletier J,Pelletier JP.Is osteoarthritis a disease involving only cartilage or other articular tissues[J]?Eklem Hastalik Cerrahisi,2010,21(1):2-14.

[3]Yuan GH,Masuko-Hongo K,Kato T,et al.Immunologic Intervention in the pathogenesis of osteoarthristis[J].Arthritis Rheum,2003,48(3):602-611.

[4]Knudson CB,Knudson W.Cartilage proteoglycans[J].Semin Cell Dev Biol,2001,12:69-78.

[5]Goldring MB.The role of the chondrocyte in osteoarthritis[J].Arthristis Rheum,2000,43:1916-1926.

[6]Miller RE,Lu Y,Tortorella MD,et al.Genetically engineered mouse models reveal the importance of proteases as osteoarthritis drug targets[J].Curr Rheumatol Rep,2013,15(8):350.

[7]Xu M,Zhang L,Zhao L,et al.Phosphorylation of osteopontin in osteoarthritis degenerative cartilage and its effect on matrix metalloprotease 13[J].Rheumatol Int,2013,33(5):1313-1319.

[8]Naito,Takahashi T,Onoda J,et al.Development of a neutralizing antibody specific for the active form of matrix metalloproteinase-13[J].Biochemistry,2012,51(44):8877-8884.

[9]Li X,Lin Q,Wang D,et al.The effects of low-intensity pulsed ultrasound and nanomagnet applications on the expressions of MMP-13 and MAPKs in rabbit knee osteoarthritis[J].J Nanosci Nanotechnol,2013,13(1):722-727.

[10]方锐,艾力江.阿斯拉,卢勇,等.兔骨性关节炎模型构建及早中晚期的特点[J].中国组织工程研究及临床康复,2010,14(7):1218-1222.

[11]黄恺,蔡海丽,吴立东,等.骨保护素对兔骨关节炎关节软骨的保护效应[J].中华骨科杂志,2013,33(9):954-960.

[12]王兰芝,姜琴英.锌离子导入治疗类风湿性关节炎[J].临床儿科杂志,1986,4(5):350.

[13]Simkin PA.Treatment of rheumatoid arthritis with oral zinc sulfate[J].Agents Actions,1981,8:587.

[14]王声雨,陶树清,荣杰生,等.骨性关节炎滑膜组织中16种无素分析[J].中国骨与关节杂志,2013,2(7):375-358.