椎间盘细胞老化信号通路及检测方法的研究进展

史航，吴小涛

(1.东南大学医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学附属中大医院 骨科，江苏 南京 210009)

椎间盘位于两个相邻的椎体之间，起连接作用，对人体的运动、稳定、平衡等有着重要的生物学意义。目前，椎间盘退行性病变的患病率显著增加，它是一种与年龄相关的疾病，引起退变的因素有很多，其共同特点是髓核细胞(nucleus pulposus chondrocyte，NPC)数量减少和功能减退、细胞外基质含量下降且比例失调,这些都涉及到椎间盘细胞老化或凋亡。椎间盘细胞的老化和凋亡是组织退变过程中非常关键的因素[1]。通过对椎间盘退变的机制研究发现，椎间盘退行性改变是从髓核细胞衰老开始，并进行程序性退变的过程[2]。

1 椎间盘细胞的老化现象

20世纪60年代初，Hayflick等[3]在体外培养人成纤维细胞时发现，在细胞连续分裂几次后即失去增殖能力，他们将这一特殊的细胞生命活动状态命名为细胞老化(senescence)。细胞发生老化时，仍具有一定的代谢活性，可分泌合成多种基质，但分泌表型已发生改变，细胞永久地停滞在G1期，无法进行有丝分裂而增殖。研究表明，大量老化细胞的集聚将会导致组织器官内功能细胞数目的减少及活性的降低，从而引起一系列如骨关节炎、皮肤衰老等退行性疾病，椎间盘的退行性变也不除外[4-5]。Evans等[6]研究发现，退变的椎间盘内存在细胞老化现象。Kim等[7]研究发现，在椎间盘退行性变中，随着年龄的增长，老化髓核细胞的数量逐渐增加，端粒酶活性降低，端粒的长度也随之缩短。Roberts等[8]研究发现，在突出的椎间盘组织中β-半乳糖苷酶(senescence associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)阳性细胞数目增多，而且髓核细胞的阳性率比纤维环细胞的要高。Gruber等[9-10]研究发现，随着椎间盘退变程度(按Thompson分级)的加重，SA-β-gal阳性率显著增加。

2 细胞老化机制及椎间盘细胞老化的信号通路

2.1 细胞老化机制

细胞老化是指体细胞在受到各种内外环境因素刺激下，复制一定次数后失去了分裂增殖能力，功能减退，不可逆地停滞在G1/S期，进入无法增殖的状态[11]。细胞老化的一个重要机制是细胞连续性分裂后，染色体端粒进行性缩短和端粒功能异常，后者模拟DNA损伤信号，上调p53基因表达，随后p53会激活其下游基因p21，从而抑制CDK2-Cyclin E的活性，降低了视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)蛋白的磷酸化程度，进而失活主要负责细胞周期递进的核转录因子E2F，形成了由p53-p21-pRB信号介导的复制性老化(replicative senescence，RS)[12-13]。此外，在某些应激因素(如异常应力、氧化应激、营养障碍等)刺激下，细胞在尚未经历过多的有丝分裂且维持一定端粒长度情况下能使p16表达上调，后者通过取代细胞周期蛋白Cyclin D与CDK4/6结合，使Cyclin D-CDK4/6活性受到抑制，从而使pRB处于去磷酸化状态而减少转录因子E2F的释放，进而阻止DNA的合成，使细胞停滞在G1/S期，从而阻碍了细胞的分裂增殖，最终形成了由p16-pRB信号介导的应激诱导的过早老化(stress induced premature senescence，SIPS)[14-15]。

目前认为，细胞老化的p53-p21-pRB与p16-pRB两条信号通路之间存在着广泛的重叠效应。研究发现，当使p16基因表达沉默后，细胞在某些应激环境下同样可发生过早老化，说明p53-p21-pRB信号通路也参与应激诱导的过早老化的发生[16-17]。此外，p16的同源蛋白p14对p53具有调节作用，p14可通过一系列反应抑制p53的降解，从而维持p53蛋白的稳定与活性[18]。Han等[19]在人类成纤维细胞中发现，p16能增加p21蛋白的稳定性，p21则通过转录因子Sp1而激活p16的基因表达，协同抑制细胞周期。

2.2 椎间盘细胞老化的信号通路

椎间盘是人体最大的缺血器官，在承受应力负荷的同时，其内的髓核细胞尚面临着缺血缺氧、营养匮乏等不利环境。研究[6，9-10]显示,在上述椎间盘环境的作用下，约30%的髓核细胞逐渐发生老化，且老化细胞所占比例随椎间盘退变程度的加重而增大。Kim等[7]通过对人类椎间盘退变机制的研究发现，在衰老的髓核细胞中均表达p53、p21和pRB，而且端粒进行性缩短，端粒酶活性降低。Liang等[20]研究证实，将端粒酶基因转入髓核细胞内，端粒酶活性明显增强，其调节的p53表达水平降低。以上研究均提示由p53-p21-pRB信号通路介导的髓核细胞复制性老化在椎间盘退行性变过程中起着重要的作用。

然而，Dang等[21]研究发现青少年甚至儿童也会发生椎间盘退行性改变。Le Maitre等[1]研究发现，在青少年退变的椎间盘中，老化的椎间盘细胞与年龄、端粒长度无明显的相关性，而与p16的高表达有关。说明p16-pRB信号通路介导的应激诱导的过早老化亦存在于椎间盘退变过程中。

3 细胞老化的基本特征及检测方法

3.1 细胞周期停滞

细胞周期停滞是细胞老化的一个基本特征，也是用于体外鉴定细胞老化的一个重要指标[22]。为了检测细胞是否跃出了细胞周期，人们通常检测增殖相关提示因子Ki-67的表达程度；或者通过将溴脱氧尿嘧啶掺入到细胞培养基中，观察是否合成新的DNA。通过流式细胞术可以观察到细胞群中处于不同周期细胞的比例：细胞老化主要表现为G1期阻滞，但也可以伴随G2/M期阻滞或者直接由G2/M期阻滞诱导形成[23-24]。

3.2 细胞形态学改变

虽然细胞周期阻滞，DNA停止了复制，但老化细胞中RNA与蛋白质含量均比正常细胞中明显增多[25]。这是因为虽然细胞进入老化阶段后，蛋白质的整体合成能力下降，但是蛋白质的降解体系受到更加明显的抑制，从而导致蛋白质在细胞内累积。同样的情况应该也发生在RNA的合成和分解过程中。这种生物大分子的积累使老化细胞的形态发生改变，如老化髓核细胞表现为细胞体积增大、胞质变脆、胞浆空泡化明显。然而，并不是所有的细胞老化都会出现上述所有类型的细胞形态学改变。例如，在一些由于基因突变或表达异常导致的细胞老化中，其细胞形态改变就不典型[22]。

3.3 老化相关β-半乳糖苷酶染色

通过细胞形态判定细胞老化存在主观性，检测细胞周期停滞缺乏直观性，往往很难在组织中直接观察到老化细胞。而与老化相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色为检测细胞老化提供了一种新的方法[26]。β-半乳糖苷酶主要存在于溶酶体内，该酶在pH 4.2～pH 4.6的条件下活性最高，在中性条件下检测不到其活性。当细胞发生老化时，溶酶体膨胀、数目增多，β-半乳糖苷酶在溶酶体中明显累积，从而保证了即使在pH 6的条件下依然可以检测到该酶的残余活性[26-27]。因此,人们将在pH 6时仍可检测到活性的β-半乳糖苷酶称为SA-β-gal。然而，β-半乳糖苷酶的活性上调也可在一些非老化的肿瘤或永生化细胞内出现，目前仍缺乏能特异性反映细胞老化状态的生化指标。尽管如此，因为其敏感性、特异性等优势，SA-β-gal染色仍然是目前检测细胞老化的多种方法中应用最广泛的一种方法。

3.4 老化相关异染色质集落(senescence associated heterochromatin foci，SAHF)形成

SAHF形成是描述细胞老化状态的一项特异指标，它的主要表现是常染色质DNA凝集，并形成致密、大小不等的异染色质颗粒[28-29]，而每一个异染色质颗粒大多来自一条单独的染色体[30-31]。SAHF在不可逆的细胞周期停滞中发挥着重要作用[28]。在SAHF中，H3型组蛋白(histone H3)第9位赖氨酸(H3K9)三甲基化水平明显增加，并以此为锚定点来吸引各亚型异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)聚集[30]；同时会出现染色质上H1型组蛋白(histone H1)的剥离和高迁移率A族蛋白(high-mobility group A proteins，HMGA proteins)、非经典组蛋白macroH2A的沉积[29，31-32]。现在普遍认为，SAHF是在p16-pRB通路和以组蛋白抑制蛋白A(histone repressor A，HIRA)为核心的组蛋白分子伴侣复合物协同作用下形成的[33]。当p16表达水平上调时，E2F的转录因子活性受到明显抑制，结合在E2F靶标基因上的组蛋白甲基化水平随之升高，从而为HP1的结合以及SAHF的形成提供了靶点[33-34]。由于SAHF的特征性结构，近年来它已经作为新的标志物用于判定细胞老化。

3.5 端粒功能异常

端粒是位于染色体末端的DNA重复序列，是由短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成的特殊结构，它能保护染色体末端免于融合和退化，在染色体定位、复制、保护和调控细胞生长等方面具有重要作用[35]。然而，由于DNA聚合酶无法完全复制染色体的滞后链，导致端粒DNA重复序列随着复制次数的增加而不断缩短，当端粒缩短到一定程度时，细胞便会开启自发性老化程序[36]。人们可以通过检测端粒序列的长度和端粒逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)的酶活性来评估端粒的功能。因而，端粒功能异常也被认为是一种可作为评判细胞老化的潜在标志物。

4 小结与展望

随着椎间盘退变的进行性加重，老化的髓核细胞在体内不断聚集，为了进一步了解椎间盘细胞老化在椎间盘退变中的机制，将来的研究可采用人正常髓核细胞系，通过体外连续培养传代、氧化应激干预分别建立髓核细胞复制性老化和应激诱导的过早老化模型，探索p53-p21-pRB和p16-pRB通路在髓核细胞老化过程中的信号介导与交通，寻找髓核细胞老化的关键调控信号及老化过程中特异性的标志物，为生物学治疗更具针对性地选择抗老化靶点来修复椎间盘退变打开崭新思路。

目前广泛应用判定细胞老化基本特征的方法有细胞周期停滞、细胞形态学改变、SA-β-gal染色、SAHF形成、端粒功能异常等。我们认为，目前尚无任何一种可以在体内外单独、可靠地鉴定细胞老化的有效方法，在缺乏老化特异性检测指标的情况下，上述多种方法的联合应用是评价细胞老化的较好选择。

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