基于电化学传感器的菌量实时检测系统

周永军，牛中奇，卢智远，张　辉，侯建强

(1．咸阳师范学院物理与电子工程学院，陕西咸阳　712000；2．西安电子科技大学电子工程学院，陕西西安　710071)

0　引言

对细菌快速、准确检测在环境检测、食品安全检测、微生物研究等方面具有重要意义。常规细菌检测方法主要有培养法、免疫学方法、分子生物学方法等，但上述方法存在耗时长，费用高，对设备、人员及环境要求高的问题，因而限制其推广普及范围。近年来，国内外专家学者关注微生物自身的热学、光学、电化学和生物化学性质，提出一系列新型微生物快速检测方法，其中生物电化学方法因具有直观、测量快速、操作简单、测量设备成本低、信号具有可控性等特点备受关注，发表了不少相关研究文章[1-5]。

基于细菌代谢和基质氧化还原机理，文中设计一种能实时测定奶乳制品含菌量的检测装置，通过与传统平板培育法的试验对比，该装置10 min给出含菌量检测值与平板培育法(培养时间24 h)测得的数值相吻合。

1　系统结构和检测原理

1．1系统结构

在自行设计并制作的生物电池盒基础上搭建了含菌量实时检测系统，如图1所示，其由微机板、电源板、生物电池盒、同轴电缆组成。

图1　系统结构原理图

1．2检测原理

式(1)为电化学能斯特方程：

(1)

式中：Φ为电池的电动势；Φ0为电池的标准电动势；c(还原态)、c(氧化态)是电池反应中各物质的浓度，mol/L；n为反应过程中得失电子数。

由上式可知随着试样含细菌量的不同，相应底物中被极化基质的量也不同，导致电极间电子失衡态势不同，阴极、阳极受理氧化、还原作用电子数量也就不同，生物电池盒信号输出就会产生变化，因此可通过检测输出信号得知被检样品的含菌量。

2　生物传感器设计

2．1生物电池盒

将色素还原法[4]应用于生物电池可实现样品含菌量的检测。设计的生物电池盒如图2所示。

图2　生物电池盒原理图

电池阴极和阳极间安装有阴离子交换膜(目的是为了防止电池盒内的被测试样与磷酸缓冲液交融)，阴极为贵重金属铂，阳极为过氧化银，缓冲液采用0．1 mol浓度单位磷酸缓冲液(其作用是为了保证不因pH值变化而使细菌的生育条件恶化)。

2．2电池盒电化学反应

细菌代谢与电子发生过程如图3所示。

图3　细菌代谢过程说明图

电池盒内基质因细菌资化而生成代谢物质，细菌使基质养分氧化最终生成H2O和CO2，细菌就是依赖此种反应能量而得以生存。辅酶(1)NAD+、辅酶(2)FAD+起着传递氢和催化作用，基质中的H因辅酶(1)催化向NAD+迁移形成NADH(可还原成NAD+)，NADH因辅酶(2)催化使FAD+受H还原为FADH，由辅酶输送的H最终被阳极氧化形成H2O．上述氧化还原存在电子(e-)的授受，有电流形成。

阳极表面溶液中的氢离子被阳极(Ag2O2)氧化形成氢离子。用化学式表示为：

Ag2O2+4H→2Ag+2H2O

(2)

综合反应式为：

4FADH+Ag2O2→4FAD+2Ag+2H2O

(3)

通过测定阴、阳极氧化、还原过程的电流或电压就可以实现含菌量的检测。该研究着眼于电压测定。

3　信号采集、处理

3．1前置放大单元

生物电池盒输出的电信号量值较小(μA级)，直接用其实现目标精确检测是非常困难(易受到外界电信号干扰)，加之考虑相位补偿、电源波动、干扰滤除及放大器自身影响等多种不利因素，故先将电池盒输出信号经如图4所示的基于ICL7650[6]的程控放大器放大后，再进行信号后续处理。

图4　基于ICL7650前置放大电路

该程控放大器不但具有较高的信噪比、高共模抑制比，高输入阻抗和低输出阻抗的特点，且其闭环放大倍数为50，可对生物电池盒输出信号进行有效放大。

3．2DSP芯片

DSP系统采用TMS320LF2407A[7]作为主控芯片，其内部集成了高速的CPU内核和各种外设器件，采用改进的哈佛结构，芯片内部具有2套分别独立的程序存储器总线和数据存储器总线，高性能静态CMOS技术，供电电压为3．3 V，指令的执行速度可以达到40 MIPS，指令周期仅为25 ns，运算速度快，具有544字片内双存取RAM；2 K单存取RAM和32 K的闪存；2个事件管理器模块EVA和 EVB；16通道A/D转换器，同时在芯片内部集成了多种的通讯外设接口，方便用户进行通讯扩展。

生物电池盒输出的微弱电信号经前置放大电路放大及滤波后，送至DSP内部的A/D转换器中，在DSP内部完成模数转换、数据存储、数据处理的工作。最终测量结果可分别通过数字和模拟形式两种情况显示出来。

4　试验结果和讨论

为了避免外界温度对测量结果影响，测量系统中设置恒温加热槽使生物电池盒内温度保持在25 ℃左右，为了避免整个试验受环境细菌影响，先用紫外线灯对操作室进行灭菌1 h且室温控制在(25±0．2)℃．

用检测装置对受到环境细菌污染(0～2 h)的8组不同状况的奶乳制品样本含菌量进行了检测。结果如表1所示，图5为它们之间的对应关系图。

表1　试验数据

图5　电压-细菌数曲线图

图5中，点代表8组不同样品中含菌量的数值和对应电压值，线为DSP中预先设定的基准曲线。从图中可见在试样无菌情况下，传感器的输出仍有57mV，这和式(1)中描述相一致。该装置可以测取103～1012区间的细菌数目，它的检测下限是在103，而文献[6]和文献[8]的细菌检测下限均在104以上，另外，还可以看出该装置测量结果具有较好的线性，但是还存在一定的误差，其原因有以下几个方面：由于生物传感器输出的电信号微弱，加上测量环境电磁干扰和放大器自身的影响；可能是加入溶液的试剂、试样和激励剂的不均匀性；测试过程中温度的变化所引起的误差。这些问题尚需要进一步解决和完善，但该技术就其简便的操作和极快的检测速度足以弥补其他方面的缺陷，测试结果表明所研制的奶乳制品含菌量实时检测系统能满足实时检测的要求。

参考文献：

[1]BURSTEIN C V．Biosensor for L-lactate determination as an index of E．colinumber in crude culture medium．Anal Chem Acta，1998，361(1)：45-51．

[2]RAMASAY G，TURNER A P T．Development of electrochemically method for microbial concentration and evidence for the reaction mechanism．Anal Chem，1988，215：61-69．

[3]谢平会，许春向．识别和计数微生物细胞的伏安型生物传感器的研究．传感技术学报，1995，8(3)：24-29．

[4]蔡豪斌．微生物活细胞检测生物传感器的研究．华夏医学，2000，13(3)：252-255．

[5]冯德荣，朱思荣．SBA-60型四电极生物传感分析系统的研制．山东科学，1998(2)45-49．

[6]吴祖国．ICL7650 斩波稳零运算放大器的原理及应用．国外电子元器件，2003(4)：41-42．

[7]江思敏 TMS320LF240X DSP硬件开发教程．北京：机械工业出版社，2003：202-212．