TUNEL法和SCGE法评价奶牛性控冻精DNA损伤

郑 飞 骆新荣 贾发青 高庆华， 韩春梅，*

(1 塔里木大学动物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)

前言

性控冻精的产业化应用对畜牧业发展，特别是奶牛业的发展产生了重大而深远的影响。随着性控冻精生产技术的日渐成熟，性控冻精也逐步向茸鹿、奶山羊等限性性状家畜广泛推广。在未来的现代化畜牧业，性控冻精将有可能替代常规冻精，使家畜品种改良，品系化杂交繁育进入一个全新的时代。

在性控冻精在制作过程中，精液的处理会对精子产生各种影响，从而造成精子DNA的较大程度损伤[1，2]，由于受精时不完全依赖于精子DNA完整性，即便是DNA受损的精子仍可保持受精潜能，产生表型健康的性控后代，但性控冻精DNA损伤会对后代的遗传稳定性的产生远期影响，即使受精后损伤的DNA有一定的自修复能力[1]。因此，性控冻精的生物安全性应被关注。

TUNEL法(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)是检测细胞凋亡早期过程中细胞核DNA完整性的有效方法。单细胞凝胶电泳(single single-cell gel electropherosis,SCGE)又称彗星法，是一种比较灵敏简便的检测DNA损伤程度的方法。本实验通过TUNEL法和SCGE法分别对性控冻精DNA的完整性进行检测，对比两种方法检测结果对性控冻精DNA的损伤程度的评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料

X/Y种畜(天津)有限公司生产规格为0.25 mL的性控奶牛细管冻精，种公牛号分别为12200145、12200171、12200176，精子数约230万，活率40～45%。三头公牛常规冻精每管精子数2 000万，活率35～40% 。

1.2 试剂

TUNEL试剂盒购自罗氏公司；低熔点琼脂糖，十二烷基肌氨酸钠，蛋白酶K，DAPI购自Promege公司，其它试剂购自南京化学试剂公司。DYY-6B型电泳仪为北京六一仪器厂，TS100-F型荧光显微镜产自日本。

1.3 方法

1.3.1 TUNEL法

严格按照试剂盒说明书进行检测，DAPI染色后在蓝色背景下观察。若为蓝色，则为阴性，DNA无损伤；若有绿色荧光，则为阳性，DNA受损。采用双盲法进行计数，随机观察100个细胞，每个样本重复5次，取平均值作为检测结果。

1.3.2 SCGE法

采用实验室已建立的SCGE法[3]，将精子密度调至2×106个/ ml左右，与1%的低熔点琼脂糖混匀，铺于被常熔点琼脂糖包被的载玻片上，4 ℃裂解1.5 h，加入预冷的DTT 4 ℃作用1 h后，用含有蛋白酶K的细胞缓冲液消化过夜。4 ℃，15 V，150 mA电泳30 min，加入Tris-HCl，4 ℃中和2次，每次10 min。-20 ℃预冷的无水乙醇作用10 min后，吖啶橙染色，荧光显微镜下观察，观察到彗星形状为阳性，反之为阴性。采用双盲法进行计数，随机观察50个细胞，每个样本重复5次，取平均值作为检测。

1.4 统计学分析

所有数据均采用SPSS 13.0统计分析，以平均数±标准差表示。对性控冻精和常规冻精的DNA损伤率进行配对t检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

由表1可知TUNEL法检测所得性控冻精DNA损伤阳性率高出常规冻精约32个百分点，差异极显著。SCGE法对性控冻精DNA损伤的检测结果相对于常规冻精比较高出约31个百分点，差异极显著。故性控冻精的DNA损伤程度极显著高于常规冻精。

表1 TUNEL法与SCGE法对性控冻精DNA损伤的检测

A常规冻精

B性控冻精

A常规冻精

B性控冻精

3 讨论

3.1 DNA损伤检测结果

本实验成功的用TUNEL法和SCGE法检测了性控冻精DNA的损伤程度，结果与常规冻精相比均出现了差异极显著的阳性率，说明精子核DNA受到损伤。结果与骆新荣等研究结果相符[3]。

相对于常规冻精，流式细胞仪分离得到的奶牛精子会受到更大程度的损伤，其功能和受精力也受到非常大的影响[4-5]。在使用流式细胞仪分选精子时，精子受到高度稀释、高压、电场等的影响[6-7]，尤其是核染色后，被激光照射会对精子DNA产生很大的损伤[8]。分选后的单性精子会处于极活跃状态，其兴奋性、运动力极强，故导致其存活时间相对较短。同时，在制作冷冻精液的过程中，精液的稀释、离心、冷冻和保护剂的添加量等都能使精子DNA的完整性受到影响。赵宏远等研究发现冷冻后的山羊精子DNA损伤程度较新鲜精液的有明显升高，差异极显著[9]。刘奕等人研究发现染色对精子DNA的完整性有一定的影响，但与正常精子相比差异不显著[10]。闫永健等人发现UVB照射对斑马鱼的早期胚胎发育有明显影响，同时随着照射时间的增加，胚胎对UVB的耐受力也增强[11]。虽然染色，激光照射等单个因素对精子的作用可能不明显，但同时作用后精子的DNA损伤就会大幅提升。有研究表明细胞的自身修复能力很强[12-13]，不严重影响受精率、出生重等指标，但我们实验室研究发现性控冻精的后代的初生重、受胎率等相对于常规冻精还是有所降低[14]。这可能与精子细胞受损伤的程度和自身修复能力有一定关系[1]。如果使用常规精液的冷冻程序(慢速降温、中性稀释液)，相当数量的精子会在冷冻前死亡，故通过改变分选后精液的冷冻程序，有望提高冻后精子的活率，降低当前每管冻精的精子数量，达到降低成本的目的。

3.2 TUNEL法和SCGE法对性控冻精DNA的损伤程度的评价

在人类男性不孕症的研究中，很多运用TUNEL法和SCGE法对精子DNA的完整性进行检验。Sergerie, M等比较了TUNEL法、SCSA法(精子染色质结构分析 sperm chromatin structure assay)和SCGE法三种方法的检测结果，认为TUNEL法和SCGE法能更好的检测出精子DNA单链及双链的断裂情况，而SCSA能检测精子DNA在组装压缩过程发生的变化[4]。O'Flaherty C等分别用TUNEL法、SCSA法和SCGE法检测睾丸癌和霍奇金淋巴瘤病人精子DNA的损伤情况，发现三种方法中SCGE法优于前两种，是检测睾丸癌病人精子DNA组装过程染色质的变化情况最好一种方法[15]。

本实验用SCGE法检测性控冻精DNA的损伤情况，结果与TUNEL法相似，说明SCGE法和TUNEL检测均可作为评价精子质量的有效方法。

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