多参数流式细胞术检测91例急性白血病免疫表型分析

李珊凤，易汉杰，金明威，陈哲，陈颖，王建华，孙伟亮，裴仁治

多参数流式细胞术检测91例急性白血病免疫表型分析

李珊凤，易汉杰，金明威，陈哲，陈颖，王建华，孙伟亮，裴仁治

目的探讨多参数流式细胞术检测急性白血病（AL）免疫表型的特点，同时与形态学分型对比以提高急性白血病实验室诊断水平。方法对就诊91例AL采用骨髓细胞形态学、骨髓细胞化学染色和细胞免疫表型分型检测方法。结果91例AL中，59例急性髓系白血病（AML）表达CD13、CD33、CD15、MPO、CD117、CD34和HLA-DR阳性率分别为93.2%、76.2%、55.9%、79.6%、89.8%、61%和62.7%；32例急性淋巴细胞白血病（ALL）中8例T-ALL表达CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8、cCD3、CD34和HLA-DR阳性率分别为75%、50%、75%、100%、25%、37.5%、100%，50%和62.5%；24例B-ALL表达CD10、CD19、CD20、CD22、CyCD79a、CD34和HLA-DR阳性率分别为45.8%、100%、33.3%、70.8%、75%、100%和62.5%。FAB分型有54例AML、29例ALL和8例AL不能分型。8例AL经免疫分型确诊为5例AML，1例T-ALL，2例B-ALL；另证实1例T/B混合型急性白血病和1例双表型急性白血病。结论AL免疫表型分析能进一步明确AL诊断，并可获得白血病细胞不同分化阶段的参数，对AL的诊断和预后判断具有重要意义，对形态学分型具有补充和修正。

白血病，急性；流式细胞术；形态学分型；免疫表型分型

急性白血病（acute leukemia，AL）是一组高度异质性恶性疾病，临床表现不典型和形态学多样化等特点是导致AL误诊的主要原因[1]。迄今，AL实验室诊断与分型主要依靠形态学及细胞化学染色分析，而形态学诊断准确率为60%～80%。自单克隆抗体与流式细胞术联合应用以来，流式细胞术已成为白血病免疫分型的重要手段。使用多参数单克隆抗体进行同时标记，可特异的、全面的检测白细胞抗原的分布情况，使AL免疫分型的结果更为客观准确[2]。本研究通过对91例AL形态学和免疫表型分型，并进行对比分析，探讨细胞形态学和免疫表型特征的关系，以提高AL实验室诊断水平。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2011年7月至2012年9月宁波市鄞州人民医院血液科就诊的AL患者共91例，其中男51例，女40例；年龄2～85岁，平均（49±24）岁；儿童19例，成人72例。

1.2 仪器与试剂瑞-姬氏染液自备。细胞化学染色试剂有细胞过氧化物酶（POX）染色、特异性酯酶（CE）染色、糖原染色（PAS）及醋酸萘酚酯酶染色（a-NAE）试剂盒均购自珠海贝索生物技术公司。异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）和别藻青蛋白（APC）标记的单克隆抗体，及红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）、破膜固定液、8-colorsetup标准微球和流式细胞仪FACSCanto II均购自美国Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞形态学诊断采集骨髓标本，离体后立即制成骨髓涂片。涂片标本经瑞-姬氏染液染色后，油镜下观察并计数200个细胞，按FAB分型法进行分型，再进行POX、CE、PAS和a-NAE染色。

1.3.2 单克隆抗体标记采集骨髓标本1～2 ml，肝素抗凝。细胞膜抗原标记方法为每管加入1×106个细胞100 l，试管内加入10l所需不同标记单克隆抗体，以四色抗体组合为主。FITC标记抗体有CD15、HLA-DR、CD14、CD10、CD22、CD2、CD3和CD61；PE标记抗体有CD117、CD13、CD33、CD19、CD7、CD8和CD235a；APC标记抗体有CD34、CD11b、CD20、CD56、CD5和CD4。每管均加入PerCP-CD45，同型对照为不同荧光染料标记的IgG1。室温避光孵育20 min后用500l红细胞裂解液溶血10min，1200r/min离心5 min后弃上清，沉淀物以2 mlPBS洗涤1次，加0.5 mlPBS重悬。细胞内抗原标记方法为每管加入1×106个细胞100 l，试管内加入10l PerCP-CD45，混匀避光孵育20 min后加入500l红细胞裂解液溶血10 min，1 200 r/min离心5 min后弃上清，再加入1∶10稀释的破膜固定液500 l避光孵育10 min，2 ml PBS洗涤1次，加入抗体MPO-FITC/CD79a-PE/ CD3-APC各10 l，室温避光孵育20 min后用500 l PBS重悬。设立不同荧光染料标记的IgG1同型对照。

1.3.3 流式细胞术检测FACSCanto II型流式细胞仪进行检测，用DIVA软件分析。样本进入流式细胞仪检测前，以8-color setup标准荧光微球校正流式细胞仪光路系统。应用前向角散射（FSC）/侧向角散射（SSC）设门去除碎片群的影响，再用CD45/SSC二维散点图上设门区别幼稚细胞群和成熟细胞群，以同型对照去除自发荧光剂非特异性荧光的影响，分析各管中幼稚细胞群免疫表型。

2 结果

2.1 细胞形态学诊断按FAB分型诊断标准，91例AL患者中59例急性髓系白血病（AML）：1例M0、3例M1、20例M2、14例M3、11例M4和5例M5，未见M6和M7，不能分型有5例；32例急性淋巴细胞白血病（ALL）中29例能明确诊断，3例不能分型。

2.2 细胞免疫分型59例AML患者的CD13、CD33、CD15、CD11b和MPO阳性率分别为93.2%、76.2%、55.9%、15.2%和79.6%，非相关系列抗原CD34、HLA-DR和CD117阳性率分别为61%、62.7%和89.8%，表达淋系相关抗原CD7、CD4、CD2和CD5阳性率分别为15.2%、8.5%、3.45%和1.7%。32例ALL经免疫分型确诊：8例T-ALL表达T系抗原CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8和cCD3阳性率分别为75%、50%、75%、100%、25%、37.5%和100%，非相关系列抗原CD34和HLA-DR阳性率分别为50%和62.5%；24例B-ALL表达B系相关抗原CD19、CD22、CD10、CD20和cCD79a阳性率分别为100%、70.8%、45.8%、33.3%和75%；CD34和HLA-DR阳性率分别为100%和62.5%。8例FAB不能分型的AL患者有5例AML、1例T-ALL和2例B-ALL。经免疫分型后5例AML确诊为1例M1，3例M2和1例M3。1例ALL经免疫分型证实为T/ B混合型AL，1例证实为双表型AL。免疫分型显示4例M1中CD4+1例；23例M2患者中表达淋系抗原有6例CD7+，2例CD2+，1例CD56+和1例CD5+；11例M4中表达淋系抗原有3例CD4+，2例CD7+和1例CD2+；5例M5中淋系抗原有1例CD7+和1例CD4+。B-ALL中表达髓系抗原有5例CD15+，2例CD13+和2例CD33+；T-ALL中表达髓系抗原有2例CD117+，1例CD13+，1例CD33+。

3 讨论

AL存在某些系列多样性和异质性，单一依据细胞形态学及细胞化学染色诊断AL已显得不足，用单克隆抗体分型白血病细胞表面的免疫标志，以进一步明确白血病细胞的起源及分化程度，为临床诊断、治疗及判断预后提供重要依据[3]。

本研究对就诊91例AL进行FAB和细胞免疫表型分型，两分型诊断相符率为91.2%。8例FAB不能分型的AL经免疫表型分型后得到确诊，为诊断和治疗提供重要的实验依据。研究表明，急性髓系白血病细胞表达髓系抗原CD13、CD33、CD117和MPO阳性率分别为93.2%、93.2%、89.8%和79.6%，表达淋系抗原CD7、CD4、CD2和CD5阳性率分别为15.2%、8.47%、5.08%和1.6%，与马瑞霞等[4]报道结果相似，但本次研究中无CD19阳性表达。随着AML发病机制研究的不断进展，有研究表明免疫分型可以作为AML危险度分层的独立因子，但具体结论尚有争议[5]。CD38、CD34和HLA-DR是干/祖细胞表达免疫标记，表达随细胞分化程度增高而减少，直至关闭，通过对以上几种标记的检测以判定是否为AL[6]。Repp等[5]对783例AML患者骨髓及外周血免疫表型分析，发现CD11b、CD13和CD34表达为预后不良因素，CD15、CD33和CD38为预后良好因子。同时，马瑞霞等[4]报道CD7在AML各分型中均有表达，可能与预后不良有关。本研究中均有上述相关抗原的检测。

T细胞早期阶段肿瘤（T-ALL，T淋巴母细胞淋巴瘤）表达早期抗原CD34或HLA-DR和T细胞抗原。B细胞早期阶段肿瘤表达早期抗原CD34或HLA-DR和B细胞抗原[7]。本研究中8例T-ALL患者CD34和HLA-DR阳性率分别为50%和62.5%，而24例B-ALL患者中CD34和HLA-DR阳性率分别为100%和62.5%，为AL细胞的分化程度提供有效数据，为临床预后判断提供有效数据。

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[2]杜秀敏,陈英剑,胡成进.59例急性白血病形态学分型与免疫分型结果对比分型[J].国际检验医学杂志,2012,33(17):2162-2163.

[3]汪永红,黄知平,李滔,等.急性白血病免疫表型及伴髓系/淋系抗原表达的比较[J].实用医学杂志,2010,26(17):3231-3233.

[4]马瑞霞,叶芳,李国霞,等.急性髓系白血病108例免疫表型特征与临床预后分析[J].中国药物与临床,2013,13(2):147-150.

[5]Repp R,Schaekel U,Helm G,et al.Immunophenotyping is an indepent factor for risk stratification in AML[J].Cytometry B Clincytom,2003,53(1):11-19.

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[7]孙晓非,何丽容,冯海林,等.多参数流式细胞术在淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤骨髓侵犯诊断的应用[J].癌症,2003,22 (11):1232-1236.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.07.071

R733.7

A

1671-0800(2014)07-0907-02

315040宁波，宁波市鄞州人民医院

李珊凤，Email：lsf1984con@ qq.com