现代色谱技术在药物分析中的应用

吴路民 刘伟芬 李禄辉

（1.辅仁药业集团有限公司，河南 鹿邑477293；2.河南省医药学校，河南 开封475004）

1 衍生技术

随着液相色谱技术的发展， 要求使用通用型的高灵敏检测器，但迄今为止，高效液相色谱还没有一个足以同气相色谱相比拟的通用型检测器。 为了扩大高效液相色谱的适用范围，提高检测灵敏度和改善分离效果，采用化学衍生法是一个行之有效的途径。 化学衍生法是借助化学反应给样品化合物接上某个特定基团，从而改善样品混合物的检测性能和分离效果。

高效液相色谱的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂(一般称作化学衍生试剂或标记试剂)与样品组分在色谱分离之前或分离之后发生化学反应，从而使得反应产物有利于色谱检测或分离。 简言之，化学衍生法主要有以下几个目的：

（1）提高对样品的检测灵敏度；

（2）改善样品混合物的分离度；

（3）适合于进一步作结构鉴定，如质谱，红外或核磁共振等。

衍生主要分为紫外和荧光衍生， 下面我们将介绍这两种衍生方法。

1.1 紫外衍生技术

紫外衍生即加入发色团使正常形式下不能被检测的物质能够检测。 发色团应具有较大的摩尔吸收系数，使其吸收光谱能尽量提高检测灵敏度，使背景噪音变小。

一般情况下用于紫外衍生的试剂要有两个重要的官能团。第一个用于控制试剂与被测物反应，第二个用于紫外检测，即发色团。

常用的紫外衍生试剂有4-溴甲基-7 甲氧基香豆醛、 对-(9-葸酰氧基)苯甲酰甲基溴化物、对-硝基苄基-N，N，-二异丙基异脲、3，5-二硝基苄基-N，N’-二异丙基异脲、溴化对-溴苯甲酰甲基、卜氨基萘(1.NA)、3，5-二硝基氯苄，4-二甲基胺偶氮苯-4-亚磺酰基、 卜萘异氰酸酯、对-硝基苄基羟胺盐酸盐、3，5-二硝基苄基羟胺盐酸盐、N-琥铂酰亚胺基-对-硝基苯醋酸酯、N-琥铂酰亚胺基-3，5-二硝基苯醋酸酯等。

1.2 荧光衍生技术

高效液相色谱的荧光检测器比紫外检测器灵敏度更高。具有强紫外吸收的化合物检测灵敏度可达ng 级水平， 而荧光衍生物的检测水平一般为10-12.1044mol／L 灵敏度比紫外检测器提高10-100 倍。HPLC 结合荧光检测方法所具有的高选择性、高灵敏度以及试样用量少的特性， 使得其对各种复杂生物样品中的分析物测定变得更加灵敏、准确、快速。 但荧光检测器要求被检测样品能被激发产生荧光。 对于荧光较弱或不产生荧光的样品灵敏度则很低，甚至不能被检测。 为了扩大检品范围，提高检测灵敏度，常采用荧光衍生法。

衍生化反应的关键是衍生试剂的选择，从实际分离和检测经验方面考虑，用于荧光衍生化反应的衍生化试剂应具备下列条件：（1）试剂应具有较大的摩尔吸光系数。（2）试剂应具有良好的发光发色性能，与分析物结合后不减弱。 （3）衍生试剂对某一官能团的衍生反应具有高度选择性。（4）过量衍生试剂易从反应产物中分离，衍生物应具有好的色谱分离稳定性。 （5）在温和条件下能够很快定量地生成衍生物。 （6）形成的衍生物的荧光信号应远高于溶剂的背景吸收，对比明显且检测灵敏度高。 （7）试剂合成方法简单，原料易得、毒性小。 （8）生成的衍生物在甲醇或乙睛溶液中有足够的溶解度。 （9）衍生物对光有足够稳定性。

目前常用的荧光衍生化试剂有：荧光胺、邻苯二甲醛、丹酰氯、4-氯-7-硝基-2，1，3-苯骈恶二唑等。 荧光胺是最常用的荧光衍生化试剂，可同伯胺及大多数氨基酸反应，反应迅速，衍生物具有高的荧光强度，而试剂本身则迅速水解为不发荧光的产物，是一种理想的柱前衍生化试剂；丹酰氯是应用最广的荧光衍生试剂，常用于含氨基药物的测定，同伯胺和仲胺都能反应，也可用于含酚羟基的药物如雌激素的测定；邻苯二甲醛，常用于伯胺类及氨基酸类化合物的荧光分析。胺类化合物的衍生试剂还有荧光素异硫氰酸酯、芴代甲氧基酰氯、4-氯-7-硝基.2，1，3.苯骈恶二唑、6-氨基喹啉琥珀酰亚胺碳酸酯等。 目前已开发出一些醇和酸的衍生化试剂。 醇、酚的衍生试剂有：羰基氯类，芴代甲氧基酰氯；磺酰氯类，丹酰氯，卤代三嗪类，1-乙氧基-4-(二氯.三嗪)萘(EDTN)；羧酸类化合物的衍生试剂有：4-溴甲基.7-甲氧基香豆素，7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯骈呋喃重氮、9-葸重氮甲烷、4-氨甲基.6，7-二甲基香豆素、9-(2-羟乙基).吖啶酮等。 羰基化合物的衍生试剂还有肼类，如DNs.H、CEOC.H；氨基类，如氨基甲基芘等。

衍生化反应从是否形成共价键来说，可分为两种：标记和非标记反应，标记反应是在反应过程中，被分析物与标记试剂之间形成共价键。而所有其它类型的反应，如形成离子对、光解、氧化还原反应、电化学反应等都是非标记反应。另一种区分衍生化反应是根据衍生反应的场所，分为柱前衍生化，柱上衍生化和柱后衍生化三种。从是否与仪器联机的角度来分有在线和离线两种。 目前在HPLC 中以离线的柱前衍生法(简称柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后衍生法)使用居多。

柱前衍生是在色谱分离前，预先将样品进行衍生，然后根据衍生物性质进行色谱分离并检测的方法，其优点是勿需考虑衍生反应的动力学因素，衍生化试剂、反应条件和反应时间的选择不受色谱系统的限制，不需附加仪器设备。缺点是操作过程较繁琐，容易影响定量分析的准确性， 且衍生反应形成的副产物可能对色谱分离造成较大干扰，从而影响分析结果。 但使用柱前衍生化方法衍生效率高，所以柱前衍生仍是目前分离分析中最常用的方法之一。

柱后衍生是将混合样品先经色谱柱分离，再进行荧光标记，最后进入检测器检测的方法，是液相色谱中比较常用的一种手段。 在分离柱和检测器之间连接一个小型反应通道，反应混合物以恒定的速度流过，使得衍生反应的操作简便、重现性好，并且可连续反应，便于实现分析自动化，因此引起了许多分析专家的兴趣。 但由于反应是在色谱系统中进行，对衍生试剂、反应时间和其它反应条件均有严格限制，需要通过控制反应通道的尺寸、流动相的流量以及反应通道的温度来实现在特定温度下特定时间内的反应，所以在一定程度上限制了它的广泛应用。

2 色谱联用技术

由于色谱和各种光谱、质谱手段的多样性，包含了各种各样的联用方式和技术，包括不同色谱技术之间的联用等。 由于对分析要求的日益增高和各种微量、高通龟色谱及光谱、电子计算机技术的发展，每种联用均得到较大发展，其中最引人注目的是色谱与质谱的成功联用与多维色谱技术。

2.1 多维色谱技术

常规的以一维色谱为核心的分析方法由于峰容量的限制，样品分析时要么采用繁琐的预处理方法，要么采用选择性的检测器，否则色谱峰重叠不可避免。 为了解决这方面的共性问题，建立多维分离方法十分必要。多维色谱分离技术是将样品注入呈正交分布的多个分离体系中，样品中各组分以进样点为原点在多维的分离方向上展开。 多维液相色谱在不同的分离阶段采用不同的分离模式，而分离阶段的数日多少被称为维度。 对于柱串联色谱系统而言，其维度依据所连接分离模式的数目可以是2.3，或更多。 因此，多维分离系统提供了比一维系统更多的分离空间，允许组分峰沿着各分离维的坐标方向展开，从而减少了峰重叠。

多维色谱实现的关键技术在于样品在两种分离模式之间的转换，接口与控制技术是该项技术应用的瓶颈。 Ste-ven[91]综述了多维液相色谱分离在生物医学和药物分析中的应用，指出在多维色谱法中样品使用的不仅仅是一种分离机制，任何一种分离机制都被看成是独立的分离维数，被测物的分析可以通过离线收集或直接在线完成。

2.2 色谱／质谱联用技术

在色谱／质谱联用技术中，气相色谱和质谱联用仪（GC/MS）是开发最早的色谱联用仪器，现已广泛用于药物滥用监测、兴奋剂检测、临床疾病诊断、药动学研究等体内药物分析。 液相色谱与质谱联用技术（HP I-C/MS）的发展主要体现在液相色谱通过各种连接口与各种质谱的联用上。 目前，大气压下的液相色谱与质谱的联用接口主要是电喷雾接口（ESI）和大气压下化学电离接口（APCI），其原理是利用气体辅助（或加高压）下流动相进行喷雾，将溶剂挥发掉，同时，流动相中的溶质分子在大气压下进行电离。 这种方式在很大程度上解决了使用LC/MS 时对流动相的限制问题， 灵敏度也得到了很大的提高。 HPLC/MS技术可以用来对新药研发的各个阶段进行整体分析，并测定和评价这些新的化学实体的各种物理和化学性质。 此外，一系列的药物代谢和药动学实验需要测定药物的吸收、分布、代谢和排泄的特征，以及分析药动学（PK）参数。 药物代谢研究是LC/MS 的一个重要的应用方面，LC/MS 除了可确定分子量以外，还可以根据特异性断裂规律推导出部分结构共至是完整的结构。LC/MS 鉴定药物代谢产物主要包括以下几个步骤：测定原形药物的质谱；选择准分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行多级质谱分析；选择原形药物的主要中性丢失，测定生物样品的中性丢失谱，图谱中的离子即为原形药物和可能的代谢物的分子离子；选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物；测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构。 串联质谱（MS/MS）是将一个质量选择的操作接到另一个质量选择的后面， 在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量。 HPLC/MS/MS 联用技术在新药研发和药物研究方面已成为一种很重要的应用技术。大部分的候选药物的分析方法都是以GC 或HPLC 为基础的，并且这种技术已经使药物代谢并入药物的研发过程中。 MS/MS 与单级MS 相比，能明显改善信号的信躁比，具有更高的灵敏度及选择性，其检测水平可以达到pg 级，其高灵敏度和宽选择性使得血浆中的药物分析发展成为快速、定量的分析。 当前，CE 的检测通常由紫外、二极管阵列或激光诱导荧光等检测器来完成。 近年来，由于MS 能提供更为丰富的有关相对分子质量和分子结构的信息， 已经成为CE 的最重要的检测技术之一，CE/MS联用技术得到很大的发展。 CE/MS 联用中，主要离子化手段有快原子轰击（FAB）和电喷雾电离（ESI）离子化；而CE 的分离模式则主要集中在CZE，MEKC，毛细管凝胶电泳（CGE）和毛细管等速电泳（CITP）等。CE/MS 联用的关键问题是CE 和MS 的接口技术。 当前主要采用无鞘接口、液体接界和鞘式液体接界等接口技术。CE/MS 虽然发展很快，但是现阶段，该技术的应用广度离常规定量检测还有很大距离。 主要问题是：较低的样品利用率以及由此产生的较弱的浓度灵敏度；与LC／MS 相比有更大的检测波动性； 分离灵敏度过于依赖样品基底离子强度等，解决这些问题必将是未来CE／MS 联用技术发展的重点。

［1］王俊德,高振华,郁蕴璐,等.高效液相色谱法[M].中国石化出版社,1992.

［2］闫旭光,梁晓波,杨玉坤.高效液相法测定中西药复方乳剂中甲硝唑的含量[J].药物分析杂志,1994,14(6)：23-24.

［3］顾小曼,李蕾.高效液相法测定银杏叶中芦丁[J].色谱,1995,13(3)：216-217.