缢蛏(Sinonovacula constricta)微卫星标记的分离及近缘物种通用性*

吴雪萍 马海涛 冯艳微 刘相全① 潘 英

(1. 广西大学动物科学技术学院 南宁 530004;2. 山东省海洋资源与环境研究院 山东省海洋生态修复重点实验室 烟台 264006)

缢蛏(Sinonovacula constrictaLamarck)俗称蛏子,属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异齿亚纲(Heterodonta)、帘蛤目(Veneroida)、竹蛏科(Solenidae)、缢蛏属(Sinonovacula), 在中国和日本沿海均有分布, 为广温广盐性的海产双壳贝类。其肉味鲜美, 营养丰富, 具有食用和药用价值, 是中国四大养殖贝类之一。近年来, 无序养殖、盲目移种, 以及海洋资源的过度捕捞和海水环境污染的加剧, 造成缢蛏种质资源混杂和野生群体数量衰减(刘博等,2013)。

微卫星DNA是指以少数几个核苷酸(多数为2—6个)为单位的多次串联重复的DNA序列, 亦称简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)、短串联重复(short tandem repeats, STR)、简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism, SSLP)等。由于其遵循孟德尔遗传规律, 具有共显性、高度多态性、数量丰富、可重复性强等特点, 已经被广泛应用于贝类遗传多样性分析及遗传连锁图谱构建等方面的工作。关于缢蛏微卫星标记的开发, 仅有少数学者作了相关报道: 牛东红等(2008)利用磁珠富集法和PCR筛选法开发了18对微卫星引物; Jiang等(2010)利用磁珠富集法开发了14对微卫星引物; 刘博等(2012)从EST数据库中开发了14对多态性引物并对乐清湾缢蛏群体进行多样性分析。但这些标记远不能满足其遗传图谱构建及数量性状位点定位(QTL)等方面的研究,急需开发出更多的微卫星标记。本研究利用磁珠富集和PCR筛选相结合的方法, 快速分离得到12对微卫星引物并在长竹蛏(Solen strictus)、大竹蛏(Solen grandis)和小刀蛏(Cultellus attenuatus)进行通用性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

缢蛏、长竹蛏及大竹蛏活体样品均采自山东省烟台市, 小刀蛏活体样品采自东营市, 取其闭壳肌保存于75%酒精中, –20°C备用。

1.2 缢蛏基因组DNA的提取及酶切

利用北京天根海洋动物组织基因组提取试剂盒提取缢蛏基因组DNA后, 再用限制性核酸内切酶Sau3AI对至少5μg的DNA进行酶切, 反应总体积50μL, 包含: 10×buffer (TaKaRa) 5μL, DNA模板40μL,Sau3AI 0.6μL, 超纯水4.4μL。经1.2%的琼脂糖凝胶检测酶切完全后, 使用生工生物(上海)有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收400—1000bp片段。

1.3 接头序列的制备及连接

等摩尔混合两条寡核苷酸链SauA: 5’-GATCGT CGGTACCGAATTCT-3’,SauB: 5’-GTCAAGAATTC GGTACCGTCGAC-3’, 经95°C变性10min后, 室温放置4—5小时使其复性。回收产物与双链接头的连接采用10μL的反应体系, 包含: 接头5μL; 胶回收DNA 3μL; 10×buffer (Takara) 1μL; T4连接酶(Takara)1μL, 16°C过夜连接。

1.4 第一次PCR扩增及纯化

PCR反应的总体积为25μL: 去离子水13.6μL;5×buffer (promega) 5μL; dNTP 1μL; Mg2+2μL;SauA(10μmol/L) 2μL; 目标DNA 100ng;Taq酶(promega)0.4μL。

PCR程序为94°C预变性5min, 94°C 50s, 60°C 50s, 72°C 1min, 30个循环, 最后72°C延伸10min。

1.5 磁珠富集

磁珠(Promega)上包被的链霉亲和素(Strep tavidin)可与探针(CA)16和(GA)16上的生物素(biotin)结合, 从而通过磁力将探针连同所需的微卫星序列一同分离出来。

1.5.1 PCR产物变性与杂交 探针杂交体系为100μL: PCR纯化产物10μL, 生物素标记的DNA探针(CA)16和(GA)16各200pmol, 20×SSC 15μL。杂交液放入PCR仪中95°C变性5min, 迅速置于冰上冷却后, 68°C温浴1h。

1.5.2 磁珠准备 取一管新鲜的磁珠(Promega),轻柔混匀磁珠悬浮液, 吸取100μL放入1.5mL灭菌离心管中, 在磁力架上除去上清后, 用100μL 0.5×SSC清洗3次并除去上清。

1.5.3 富集

(1) 将杂交混合液加入到磁珠管中, 25°C放置30min, 每10min 混匀1次, 除去上清;

(2) 用100μL 6×SSC, 室温清洗2次, 每次4min;

(3) 用100μL 3×SSC, 68°C清洗2次, 每次13min;

(4) 用 100μL 6×SSC, 室温清洗2次, 每次8min。

1.5.4 捕获含微卫星序列的单链DNA 除去上清,加入30μL灭菌水, 转入PCR管, 95°C热洗脱10min,迅速吸取上清液至另一灭菌1.5mL离心管中, 即为杂交后单链DNA。

1.6 第二次PCR扩增含微卫星序列的DNA片段

以SauA为引物, 对富集的DNA单链片段进行PCR扩增, 25μL反应体系:SauA 2μL, 5×buffer(Promega) 5μL, dNTP 1μL, Mg2+2μL, 目标DNA 6μL,Taq酶0.4μL。1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后经生工生物(上海)柱式PCR纯化试剂盒去除多余的dNTP、SauA等, 置于4°C备用。

1.7 富集片段的T载体连接和转化

使用 pMDTM20-T Vector Cloning Kit (Takara)对纯化后的DNA片段进行连接。载体连接的反应体系为10μL: pMDTM20-T Vector 1μL; solution I 5μL; 纯化DNA 4μL。16°C反应连接过夜。将全部连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 37°C振荡培养箱培养1h, 菌液涂于含有IPTG、X-gal的氨苄青霉素抗性LB平板上, 37°C培养12h, 挑取阳性克隆在含LB液体培养基(含氨苄青霉素抗性)的96孔细胞培养板中, 37°C培养12h。用载体引物M13-47、RV-M及无生物素标记的探针序列(CA)12或(GA)12对随机挑选的白斑克隆进行PCR菌落鉴定。扩增得到的PCR产物通过1.2%琼脂糖电泳检测后, 克隆中若存在相应微卫星核心, 每条产物带应为2条或2条以上。将符合上述条件的菌落送往上海英俊生物公司测序。

1.8 引物设计

测序结果用SSR Hunter软件查找含有微卫星核心的序列, Primer Premier 5.0 (http://www.premierbiosoft.om/)软件进行引物设计, 并挑选部分引物送生工生物(上海)有限公司进行合成。

1.9 引物筛选及检测

利用三个样品对合成引物进行退火温度梯度PCR扩增, PCR反应体系10μL包括: 模板DNA 100ng,引物F 10μmol/L, 引物R 10μmol/L, 10×Buffer 1μL,dNTP 2mmol/L, MgCl21.5mmol/L,Taq0.25 U。PCR反应程序: 94°C, 3min, 94°C, 45s, 退火温度45s, 72°C,45s, 35个循环数, 72°C终延伸5min。通过琼脂糖凝胶电泳, 选出能获得清晰条带的引物, 并确定每对引物的最适退火温度。然后用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 以缢蛏30个个体进行群体多态性分析。

用软件MICROSATELLITE ANALYSER (MSA)(Dieringeret al, 2003)统计每个微卫星位点的等位基因数、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(He)及期望杂合度(Ho); 用GENEPOP v.4.1.4 (Rousset, 2008)进行每个微卫星位点哈迪-温伯格平衡指数计算以及位点间连锁不平衡分析; 用软件CERVUS 3.0 (Marshallet al, 1998)分析各微卫星位点的多态信息含量值(Polymorphic Information Content, PIC)。

1.10 近缘种中的通用性研究

筛选出的12对缢蛏微卫星引物, 在长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏各12个个体中进行PCR扩增, 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 硝酸银染色检测扩增结果。扫描仪记录电泳图谱, 根据电泳图谱分析各个微卫星位点在三个近缘种中的扩增情况。

2 结果

2.1 测序结果分析

32个缢蛏测序样品中, 有21个含有微卫星序列,共设计出17对引物。依据Weber等(1990)提出的微卫星的划分标准, 微卫星的类型包括完美型(perfect)、非完美型(imperfect)和复合型(compound)。完美型微卫星是指无中断的重复序列, 非完美型是指具有1个或者多个中断的重复序列, 复合型则为3个以下的非重复碱基间隔不同的重复序列或者不间隔直接相连。其中完美型占52.38%, 非完美型占33.33%, 复合型占14.29%。这些微卫星含的重复单元观察到的有CA、GA、TG、AG、TACA、AAC、CAAG,其中CA重复次数最低为5次, 最高可达58次; TG最低为7次, 最高为37次。

2.2 多态性微卫星位点的筛选结果

经筛选后得到12个多态微卫星位点(表1)。所有位点在缢蛏30个个体中进行扩增, 经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(图1)。结果显示: 每个位点的观测等位基因数为2—15个, 有效等位基因数为1.0339—8.8063个; 观测杂合度(Ho)为0.0333—1.0000, 平均观测杂合度为0.7525; 期望杂合度(He)为0.0333—0.9020, 平均期望杂合度为0.6866; 多态信息含量(PIC)为0.0320—0.8680。所有位点中, 有8个位点属于高度多态位点(PIC>0.5), SC1-5和SC4-6属于低度多态位点(PIC<0.25); 经Bonferroni校正后, 无显著偏离哈迪-温伯格平衡的位点; 连锁不平衡检验结果表明, 位点间不存在连锁不平衡现象。

2.3 缢蛏微卫星引物对长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏的通用性

对所有引物在近缘种长竹蛏、大竹蛏和小刀蛏的通用性情况进行了分析, 结果显示: 长竹蛏中, 共有8对引物扩增出了相应大小的产物, 位点SC1-7、SC1-12、SC4-4、SC4-6表现为单态, 位点SC1-4、SC2-8、SC3-1、SC3-14表现出了高度多态性(PIC>0.5);大竹蛏中, 有8对引物可扩增出目的条带, 位点SC1-12、SC3-1、SC3-14、SC4-4表现为单态, 而位点SC3-4、SC3-7、SC4-6表现出了高度多态性(PIC>0.5), SC2-9为低态位点(PIC<0.25); 小刀蛏中,共有7对引物扩增出了目的条带, 位点SC1-12、SC3-4表现为单态, 而位点SC1-7、SC2-9、SC3-1、SC3-14表现出了高度多态性(PIC>0.5), SC4-6为低态位点(PIC<0.25)(表2)。

3 讨论

3.1 缢蛏微卫星标记的筛选结果分析

真核动物基因组中, 认为二核苷酸序列(CA)n(Brenneret al, 1993)或者(GA)n(Zhanet al, 2005)的重复十分丰富, 每50—150kb就会在哺乳动物基因组中出现一次(Oritet al, 1997)。本研究以生物素标记的(CA)16和(GA)16为探针, 通过磁珠富集缢蛏微卫星序列, 并采用三引物法筛选阳性克隆, 筛选的66个白斑菌落中, 检测出32个阳性克隆含有微卫星片段,阳性克隆率为48.48%。这一方法可提高检测阳性克隆中的微卫星序列的准确性, 也可专一确定核心序列(CA)n或者(GA)n, 此次也检测出三碱基、四碱基重复元件。Winter等(1992)认为不同物种间3种类型的微卫星(完美型、非完美型和复合型)在真核生物基因组中存在差异, 完美型所占比例一般显著高于非完美型。在缢蛏中, 这3种类型所占比例分别为52.38%、33.33%和14.29%, 与其他水产经济动物的研究结果一致(赵莹莹等, 2006)。

图1 SC3-14、SC4-4在30个缢蛏个体中的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of two loci (SC3-14, SC4-4) in 30 S. constricta individuals

3.2 缢蛏微卫星标记在近缘种中的通用性分析

微卫星侧翼序列在属内种间和有较近亲缘关系的种间相当保守, 并且在有较远亲缘关系的分类群中也具有一定的保守性(Ricoet al, 1996)。海萨等(2009)用10对伊犁鲈(Perca schrenkii)引物在河鲈(P.fluviatilis)中有4对适用, 而在黄金鲈(P. flavescens)中有2对。本实验中, 12对缢蛏微卫星引物在同属的长竹蛏及大竹蛏中均有8对引物可扩增, 扩增效率为66.67%, 表现出了很高的通用性, 其中均有4对引物属于单态; 在不同亚科的小刀蛏中也有7对引物可扩增, 扩增效率为58.33%, 其中2对引物属于单态。该结果表明这些微卫星位点的侧翼序列在长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏中具有较高的保守性。

一般用杂合度、有效等位基因数及多态信息含量来衡量遗传标记的多态性高低和其应用价值。据Botsein等(1980)提出的量度基因座位变异程度高低的多态信息含量标准: 当PIC<0.25时, 此位点表现为低度多态性; 当0.250.5, 则表现为高度多态性。本研究结果显示: 在长竹蛏中, 有4个高度多态位点(PIC>0.5);在大竹蛏中, 有3个高度多态位点(PIC>0.5); 在小刀蛏中, 有4个高度多态位点(PIC>0.5), 这些位点均可直接用作长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏的遗传多样性分析。

3.3 缢蛏微卫星标记在近缘种中扩增状况差异

微卫星核心单元重复次数的差异及其侧翼序列的突变(DNA片段插入或缺失)均可导致物种间等位基因长度分布范围的差异, 这种差异可用于鉴定物种特别是近缘种(Chistiakovet al, 2006)。林能锋等(2008)用大黄鱼(Pseudosciaena crocea)微卫星标记对石首鱼科进行通用性分析中发现: 黄鱼亚科(Pseudosciaeninae)、叫姑鱼亚科(Johniinae)及牙亚科(Otolithinae)中的近缘种在一些微卫星位点上的等位基因长度分布范围存在很大差异。本研究也发现长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏在一些微卫星位点上的等位基因长度分布范围存在差异。例如, 微卫星位点SC2-8、SC3-7在缢蛏中等位基因片段大小范围分别为300—348bp、176—212bp, 但SC2-8在长竹蛏中为188—214bp, SC3-7在大竹蛏中为250—256bp。

另外, 等位基因数目的不同也可作为鉴定近缘种的一个指标(Turneret al, 2004)。McQuown等(2000)将108对铲鲟(Scaphirhynchus platorynchusRafinesque)引物在高首鲟(Acipenser transmontanus)、湖鲟(Acipenser fulvescens)及中吻鲟(Green sturgeon)中扩增, 表现为多态的引物分别占9.2%、22.2%和11%。本次实验中也发现缢蛏中扩增效果好且等位基因较多的微卫星引物, 在长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏中等位基因数较少或者表现为单态, 如位点SC4-4在缢蛏中属于高度多态位点(PIC=0.7601), 而在长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏中均属单态。

微卫星标记在近缘种间的通用性可降低其开发成本, 提高利用率, 也有利于促进遗传研究较为薄弱物种的分子遗传学研究。本文将开发出的微卫星标记在其近缘种中进行通用性分析, 这些通用引物将为长竹蛏、大竹蛏及小刀蛏遗传多样性评价、连锁图谱的构建等方面的研究提供帮助, 对尚未见微卫星引物开发报道的长竹蛏及小刀蛏意义尤为重大。

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