耐药鲍曼不动杆菌氟喹诺酮类耐药基因研究

蒋佩军，许小敏，冯伟云，梁珊燕

耐药鲍曼不动杆菌氟喹诺酮类耐药基因研究

蒋佩军，许小敏，冯伟云，梁珊燕

目的了解耐药不动杆菌氟喹诺酮类耐药基因的存在状况。方法GNS-448药敏卡及K-B法测定抗菌药物的敏感性，聚合酶链反应（PCR）检测靶位DNA回旋酶编码基因（gyrA）与拓扑异构酶Ⅳ编码基因（parC）之氟喹诺酮耐药决定区突变分析，以及可移动遗传元件可介导的喹诺酮类耐药基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr]。结果20株不动杆菌对12种常用抗菌药物严重耐药，对左氧氟沙星耐药率85%，亚胺培南90%，美洛培南耐药率达到95%。19株耐药鲍曼不动杆菌均检出gyrA基因氟喹诺酮耐药决定区(QRDR)第83位密码子TCA→TTA有义突变（氨基酸序列Ser→Leu）；20株不动杆菌中，parC基因均检出存在QRDR区第80位密码子TCG→TTG有义突变（氨基酸序列Ser→Leu）；没有检出耐药鲍曼不动杆菌可移动遗传元件可介导的氟喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr。结论鲍曼不动杆菌氟喹诺酮类药物的耐药机制主要与gyrA和parC基因QRDR区突变相关。

不动杆菌，耐药；-内酰胺酶基因；氟喹诺酮类；耐药基因

据我国Mohnarin 2011年的监测报告显示，鲍曼不动杆菌重症监护病房（ICU）分离率为21.9%，占ICU病房分离率首位。ICU病房鲍曼不动杆菌分离株的-内酰胺类药物耐药率高出同期铜绿假单胞菌分离株的1倍以上，氨基糖苷类耐药率高出同期铜绿假单胞菌分离株的2～3 倍，氟喹诺酮类药物耐药率高出同期铜绿假单胞菌分离株的2倍以上[1]。为了解一组（20株）耐药鲍曼不动杆菌氟喹诺酮类药物耐药机制，笔者对氟喹诺酮类药物作用靶位DNA回旋酶编码基因（gyrA）与拓扑异构酶Ⅳ编码基因（parC）之氟喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变分析，以及可移动遗传元件可介导的喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6')-Ⅰb-cr)进行检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株收集20株耐药鲍曼不动杆菌分离自2011年2—10月宁波市第二医院和浙江省舟山市普陀区中医院住院患者。

1.2 菌种鉴定及药敏试验由于常规生化鉴定法无法区分鲍曼不动杆菌/乙酸钙不动杆菌复合体，因此菌种鉴定为先用法国生物梅里埃公司全自动微生物鉴定仪作初步筛查，继而本研究参照文献[2]，采用gyrA测序并经BLASTn比对进一步确认为鲍曼不动杆菌。gyrA测序试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。药敏试验为K-B法，抗菌药物敏感性判断根据2011年CLSI进行。

1.3 细菌基因检测模板制备挑取经纯培养的单个菌落，置入0.5m leppendorf离心管（内有新鲜配制浓度为200 g/L的蛋白酶K溶液400 l），放置56℃水浴2h(消化细菌细胞膜裸露DNA)，然后改放置95℃水浴10 m in(灭活蛋白酶K)。放置－20℃冰箱保存备用。

1.4 基因检测gyrA、parC基因以及可移动遗传元件可介导的喹诺酮类耐药基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰbcr]检测均为PCR法，氟喹诺酮类药物作用靶位基因gyrA与parC经PCR扩增后另作DNA测序。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。PCR参数、靶基因PCR引物序列和基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。靶基因引物序列和目的产物长度见表1。

1.5 gyrA、parC基因测序PCR产物测序在美国ABI公司3730型毛细管全自动测序仪上进行)，委托铂尚(上海)生物技术有限公司完成。

1.6 gyrA、parC基因测得序列比对读序工具软件为Chromas，测序结果用Chromas直接作BLASTSearch比对。

2 结果

2.1 药敏检测结果20株耐药鲍曼不动杆菌对头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁的耐药率均85%以上；亚胺培南和美洛培南耐药率分别为90%和95%；哌拉西林/他唑巴坦耐药率84.2%；左氧氟沙星耐药率85%；对庆大霉素和阿米卡星30%和10%；氨苄西林/舒巴坦耐药率21.1%。

2.2 基因检测状况20株耐药鲍曼不

动杆菌均检出gyrA基因氟喹诺酮耐药决定区(QRDR)第83位密码子TCA→TTA有义突变(氨基酸序列Ser→Leu)，parC基因均检出存在QRDR区第80位密码子TCG→TTG有义突变(氨基酸序列Ser→Leu)，未检测去移动遗传元件可介导的氟喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')Ⅰb-cr。

3 讨论

喹诺酮类药物是一族结构类似于萘啶酸的人工合成抗菌化合物，均有一个喹酮环，并含氟原子，故亦称氟喹诺酮类药物。氟喹诺酮类药物作用强于萘啶酸。研究表明，氟喹诺酮类药物会破坏细菌的DNA回旋酶与拓扑异构酶Ⅳ傕化的DNA双链被切断的断端重新拼接反应，造成切断的DNA双链堆积，细菌DNA复制无法完成而死亡[3]。氟喹诺酮类药物曾是治疗鲍曼不动杆菌临床感染的替代性药物。但如今鲍曼不动杆菌临床分离株对氟喹诺酮类药物耐药性也在不断上升趋势。

革兰阴性细菌耐氟喹诺酮类药物原因主要为DNA回旋酶或拓扑异构酶Ⅳ的编码基因gyrA、parC突变所致。后来，国内外学者相继报道了肠杆菌科细菌的可移动遗传元件可介导的氟喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6')-Ⅰb-cr)。本文结果发现，19株耐药鲍曼不动杆菌均检出gyrA基因QRDR区第83位密码子TCA→TTA有义突变(氨基酸序列Ser→Leu)。parC基因均检出存在QRDR区第80位密码子TCG→TTG有义突变(氨基酸序列Ser→Leu)。与本组菌株氟喹诺酮类药物均不敏感的表型一致。而可移动遗传元件可介导的氟喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr均没有检出。这一结果文献[4]报道相同。即鲍曼不动杆菌氟喹诺酮类药物的耐药机制主要与gyrA和parC基因QRDR区突变相关，喹诺酮类药物与之结合位置发生了改变，所形成氢键的数量也减少[5]，导致突变后的基因表达产物(变异的DNA回旋酶或拓扑异构酶Ⅳ)逃逸了氟喹诺酮类药物的攻击。

表1 基因检测PCR引物识别序列和目的产物长度

[1]沈萍,魏泽庆,陈云波,等.Mohnarin2011年度报告:ICU细菌耐药性监测[J].中华医院感染学杂志,2012,22(24):5472-5476.

[2]褚少朋,汪桂华,景蓉蓉,等.一组泛耐药鲍曼不动杆菌中发现拓普异构酶Ⅳ编码基因新的变异型[J].中华微生物和免疫学杂志,2012,32(2):157-160.

[3]克里斯托弗·沃尔什.抗生素[M].北京,中国轻工业出版社,2009:60-61.

[4]耿先龙,王春新,许亚丰,等.泛耐药鲍氏不动杆菌中发现拓普异构酶Ⅳ编码基因新的变异型[J].中华检验医学杂志,2012,35 (11):1048-1050.

[5]Vashist J,Vishvanath,Kapoor R,etal.Interactionofnalidixicacid and ciprofloxacin with type and m utated quinolone-resistance-determ ining region of DNA gyrase A[J].Indian JBiochem Biophys,2009,46 (2):147-153.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.06.064

R446.5

A

1671-0800(2014)06-0756-02

316000 浙江省舟山，舟山市普陀区中医院（蒋佩军）；宁波市第二医院（许小敏、冯伟云、梁珊燕）

蒋佩军，Email:hhllis@163. com