锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF126 基因的原核表达及免疫试验研究

王 好，王秋举，刘艳辉，张雅斌，吕文亮，周井祥

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林省水产科学研究院，吉林 长春 130033）

我国作为亚洲主要的鲤鱼养殖国家，其产量占全球的70%。因此改进鲤鱼的养殖方法增加产量是解决全球粮食问题的一个重要途径[1-2]。但是20 世纪90 年代早期暴发的一种高度传染和急性致死的疾病给全球的鲤鱼养殖业带来了巨大的经济损失[3]。这种疾病的快速传播可能与国际间的鱼类贸易有关[4]。根据病毒的形态学特征这种疾病最初被命名为锦鲤疱疹病毒[5]。由于这种病毒主要损害鲤鱼的鳃和肾，因此又将这种病毒命名为鲤鱼间质性肾炎和鳃坏死性病毒[5]。最近，基于该病毒的基因组与其他鲤科疱疹病毒的同源性建议将该病毒命名为鲤科疱疹病毒3 型（CyHV-3）[6]。

自从该病于20 世纪90 年代在美国、欧洲以及以色列暴发以来[4，7-9]，CyHV-3 已经成为鲤鱼主要的疾病之一[3，10-12]。2002-2003 年期间，CyHV-3 造成日本[13]，印度尼西亚[10]和台湾[12]等亚洲许多国家和地区养殖鲤鱼的大量死亡。该病的发生与温度有密切的关系，该病主要发生在水温18 ℃～28 ℃的春秋季，当水温上升到30 ℃时很少发病，这可能是因为在这个温度时病毒的增值和基因转录停止[14]。

由于KHV的高感染率和死亡率造成的巨大经济损失，但目前为止还没有有效地药物来治疗本病。所以疫苗免疫就显得尤为重要。本试验选择锦鲤疱疹病毒糖蛋白基因ORF126 作为研究对象，对其进行原核表达和相应的免疫原性的研究为锦鲤疱疹病毒的预防探索一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 锦鲤疱疹病毒吉林株（KHV-CJ）系由吉林农业大学重点实验室分离保存[15]；锦鲤尾鳍细胞系由吉林农业大学重点实验室培养保存；ELISA试验兔抗鱼二抗为实验室自制；500-600 g健康鲤鱼，购自未发生KHV的长春某渔场，抽检部分鱼，经PCR检测KHV阴性。新生牛血清、M199 培养基，购自GIBCO公司；ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRI 和HindⅢ、DNAMarker，购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA），购自上海锐谷生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2 载体与菌株 pMD18-T 购自宝生物工程（大连）有限公司，E.coli.DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。pET-32a 为本实验室保存。

1.3 引物的设计与合成 从GenBank（登录号:AP008984.1）上下载KHVORF126 的全基因序列，用软件Primer Primer 5.0 设计1 对引物，上游引物（F1）为：5′-GAATTCATGATGAGGATCCTTCTGCTA-3′，下游引物（F2）为：5′-AAGCTTCTAAGCCGTGATCAGGTC-3′，分别在引物上、下游的5′端加入EcoRI 和HindⅢ酶切位点（划线部分）；引物设计完成后送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF126基因的扩增 将本实验室保存的锦鲤疱疹病毒中国吉林株接种在鲤鱼尾鳍单层细胞上，每日观察细胞的病变情况，当病变达到70%～80%时收集病毒，按照常规方法提取病毒的DNA，应用25 μL 反应体系进行PCR扩增，反应条件如下：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。35个扩增循环，最后，反应体系于72 ℃中延伸10 min，结束反应后4 ℃保存。

1.5 锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因的克隆与鉴定 将目的片段纯化回收后在4 ℃下与pMD18-T 载体过夜连接后；将连接产物全量转化入DH5α感受态细胞中，用含1 μg/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基筛选单菌落，提取质粒后用PCR鉴定（PCR 程序如上）和EcoRI 和HindⅢ进行双酶切鉴定，命名为pMD18-T-ORF126，阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因原核表达载体的构建 将pMD18-T-ORF126 和pET-32a 分别用EcoRI 和HindⅢ双酶切，纯化回收目的片段后，16 ℃过夜连接，连接体系为：目的片段：10 μL，pET-32a 大片段：1 μL，10 倍T4 Buffer：1 μL，T4 DNA连接酶：1 μL，ddH2O：1 μL，总体系为15 μL。

1.7 锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF126基因原核表达载体的鉴定 将连接产物总量转化化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用含1 μg/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基筛选单菌落，提取质粒后分别用PCR（PCR 程序如上）和用EcoRI 及HindⅢ双酶切进行鉴定，阳性质粒命名为pET32a-ORF126。

1.8 重组质粒的诱导表达 将鉴定正确的阳性质粒pET32a-ORF126 转化入大肠杆菌BL21 中，用含1 μg/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基筛选单菌落，挑取单个菌落接种于含1 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃过夜培养后，按1%接种于新鲜的LB液体培养基中培养，37 ℃震荡培养至OD600为0.6 时，加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L 诱导表达2～4 h。SDS-PAGE 电泳后考马斯亮蓝染色观察。

1.9 表达蛋白的纯化及蛋白质浓度的测定 将表达后的菌液反复冻融3 次用Ni-Denature-GuHCl 裂解表达菌，经超声破碎后利用Ni-NTA-琼脂糖凝胶层析柱进行纯化。

用分光光度计测定蛋白质的浓度，分别在OD280nm 和OD260nm 的光密度下测定蛋白质的浓度。

1.10 抗体水平检测 将纯化后的蛋白1∶1 加不完全佐剂，按10 μg/mL，20 μg/mL 和40 μg/mL 的浓度分别免疫3 组鱼，同时设置空白和生理盐水两组作为对照组，每组10 条鱼。分别在免疫后4，7，10，14，18，24 d 和28 d 采血收集血清，用间接ELISA检测抗体的水平。

2 结果

2.1 锦鲤疱疹病毒吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因的扩增 PCR 扩增出一条与目的基因大小一致的片段（图1）。

图1 锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF126基因PCR扩增

2.2 锦鲤疱疹病毒吉林株（KHV-CJ）重组质粒pMD18T-ORF126 鉴定 PCR扩增出1 条与目的基因大小一致的片段。pMD18-T-ORF126 用内切酶EcoRI 和HindⅢ双酶切后获得1 条大小约为822 bp 的片段，说明ORF126 基因已成功克隆到载体中。

2.3 重组质粒pET32a-ORF126 鉴定

2.3.1 PCR 鉴定 用提取的重组质粒pET-ORF126作为模板进行PCR 扩增，结果获得了长为822 bp 的片段，与目的基因大小一致。

2.3.2 酶切鉴定 对重组质粒pET-ORF126 用EcoRI 和HindⅢ双酶切后得到与ORF126 大小一致的一条822 bp 的片段和一条大于822 bp 的片段。

2.4 重组蛋白的表达 ORF126 表达蛋白的理论大小为29.9 kDa，pET-32a 自带20 kDa 左右的融合蛋白，重组蛋白的总分子量为49.9 kDa；诱导表达后的重组蛋白经SDS-PAGE 分析，如图2，诱导的样品在51 kDa 左右有1 条蛋白带，与理论结果相符。

2.5 纯化蛋白的浓度 镍柱纯化的蛋白经分光光度计测定重组质粒pET32a-ORF126 表达蛋白的浓度为0.416 mg/mL。

图2 pET32a-ORF126的IPTG诱导表达

2.6 抗体水平 用间接ELISA检测不同天数的抗体水平见表1。

表1 鲤鱼血清ELISA抗体水平检测 （OD450）

用不同剂量蛋白免疫后均可检测到KHV的抗体。表1 数据经t检验，用pET32a-ORF126 表达的蛋白10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗体水平差异不显著（P＞0.05）。

图3 不同剂量表达蛋白免疫鲤鱼血清ELISA抗体水平检测结果

3 讨论

锦鲤疱疹病毒病已经给我国的鲤鱼养殖业造成了巨大的经济损失。目前，还没有药物能够治疗本病，免疫接种是预防本病发生和传播的有效途径。因此，必须研究更安全有效地疫苗。

本试验经克隆获得了长为822 bp 的ORF126基因的全基因序列,将锦鲤疱疹病毒（KHV）囊膜蛋白基因ORF126 将其克隆至pET32a 中，构建了重组载体并转化入大肠杆菌BL21 中，经IPTG 诱导，SDS-PAGE 结果显示，插入的外源基因在大肠杆菌中表达出约为49.9 kDa 融合蛋白。用纯化的蛋白免疫鱼后用间接ELISA检测抗体水平；ELISA检测结果表明，用10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后均可检测到KHV的抗体，用pET32a-ORF136 表达的蛋白20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗体水平比10 μg/尾剂量蛋白免疫后的抗体水平高且差异不显著（P＞0.05），且维持的时间也较长；而用pET32a-ORF126 表达的蛋白10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗体水平差异不显著（P＞0.05）。

为研制预防锦鲤疱疹病毒的疫苗以及可能应用于检测本病的待选目标蛋白，本研究选择锦鲤疱疹病毒（KHV）ORF126 基因作为研究对象并用ELISA检测免疫表达的蛋白后不同时间的抗体水平确定其免疫效果，为疫苗的研究探索一条新路。

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