DC 对系统性白假丝酵母菌感染保护性研究①

徐美兰 刘金星 陈美任 (嘉应学院医学院附属医院，梅州 514031)

近年来白假丝酵母菌在医院感染中成为最常见的条件致病性真菌。临床上随着体内治疗装置的植入及器官移植等使白假丝酵母菌感染率不断上升，深部白假丝酵母菌感染病死率高达40%［1-3］。其主要原因是目前用于治疗真菌的药物数量有限且部分真菌已产生耐药。所以研发有效的疫苗对白假丝酵母菌感染防治具有重要意义。

DC 作为体内最重要的抗原提呈细胞(APC)，其表面多样性的受体是其识别并捕捉各种形态真菌的物质基础，具有强大的提呈抗原作用和启动初始T 细胞的能力。DC 通过细胞表面的甘露糖-岩藻糖等受体［4］，识别和吞噬念珠菌，然后到达组织引流次级淋巴器官，分化成成熟的DC，从而有效地启动T 细胞增殖和分化。

在系统性白假丝酵母菌感染过程中，体液免疫和细胞免疫应答都发挥了重要的防御作用。本课题组将致敏的DC 免疫小鼠，观察其对系统性白假丝酵母菌感染的保护效果的研究，现总结如下。

1 材料与方法

1.1 白假丝酵母菌标准菌株ATCC14053(均由本实验室储存)。KM 系小鼠:5～6 周龄约30 g，购于汕头大学动物实验中心(合格证号:SCXK2012-0017)。小鼠DC2.4 细胞(DC 细胞来源于小鼠骨髓)、IL-4、IFN-αmouse ELISA 试剂均购于上海希尔顿有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白假丝酵母菌孢子与菌丝混合液致敏小鼠DC 白假丝酵母菌于沙堡培养基纯培养48 h，菌液浓度调至5 ×105ml-1;取沙堡培养基上白假丝酵母菌转种于YPD 液体培养基，置摇床振荡培养48 h，离心弃上清，加入含小牛血清(FCS)的RPMI1640培养基，调菌数为5 ×105ml-1，置37℃水浴箱培养3 h，得菌丝相白假丝酵母菌［5］。将上述白假丝酵母菌孢子液与菌丝液相等量混合，以2 倍于DC数的白假丝酵母菌孢子混合液与小鼠DC 混合，37℃孵育1 h，牛血清白蛋白梯度离心后收集分界层细胞［6］，PBS 洗涤2 次，调DC 浓度为1 ×106ml-1置于冰浴上。每次取100 μl 小鼠尾静脉注射。

1.2.2 动物试验 小鼠随机分为2 组，每组10 只。DC 组为预处理DC 100 μl 与福氏完全佐剂等体积混合物，分别于第1 天、第7 天及第14 天经尾静脉注射，对照组注射等量PBS。环磷酰胺具有免疫抑制作用，经动物试验得80 mg/kg 造系统性白念珠菌感染小鼠模型效果较佳。免疫接种后各组小鼠接受免疫抑制剂给予环磷酰胺80 mg/kg，背部皮下注射，连续2 d;再用菌量为0.2 ml×106ml-1的白假丝酵母菌孢子及菌丝混悬液经尾静脉注射形成系统性白假丝酵母菌感染动物模型［7］，观察小鼠生存期、肾脏做病理切片，眼球取血送广州华银检验中心检测CD4+、CD8+，取血清按试剂说明书检测IL-4 及IFN 水平。

2 结果

2.1 生存期及CD4+、CD8+、IL-4、IFN-α 检测 对照组小鼠第1 天(d)死亡2 只，至第3 d 内全部死亡;DC 组3 d 死亡1 只，第7 天死亡4 只，其余存活至观察期结束。经Kaplan-Meier 分析，对照组和DC组间有统计学意义(P ＜0.05)，详见表1。

2.2 小鼠肾病理切片 DC 组肾小球轻度水肿，镜下可见少量白细胞及红细胞，未见管型;对照组水肿充血较明显，镜下可见大量红细胞、白细胞，可见白细胞管型，肾小球结构不完整。详见图2。

表1 小鼠生存时间与生存状况及CD4 +、CD8 +百分比，白细胞介素4，干扰素α 统计学分析Tab.1 Analysis of survival time and living condition of mouse，percentage of CD4 +CD8 +and IL-4，IFN-α

图1 CD4 +CD8 +流式检测结果Fig.1 FCM result of CD4 +CD8 +

图2 小鼠肾病理切片Fig.2 Kidney pathological section of mouse

3 讨论

白假丝酵母菌是二相性真菌，其孢子和菌丝相致病力及侵袭力各不相同，因此本试验采用两者的混合液致敏小鼠DC。DC 对双相白假丝酵母菌具有极强的可塑性，可以识别不同形态、不同表面标志而表现出不同的生物学特性［9］。在念珠菌感染中，不同状态的白假丝酵母菌能够以不同途径进入DC［10］。酵母状态的白色念珠菌被吞噬后，在细胞内形成吞噬溶酶体，DC 分泌NO 和IL-12，调节CD4+Th 细胞向Th1 型分化，在体内产生有效的抗真菌反应;而菌丝体状态的白色念珠菌通过传统的拉链途径被吞噬入胞，会裂解体膜，躲避在细胞浆中。本实验将致敏的DC 接种免疫小鼠，当DC 在小鼠体内再次接触白假丝酵母菌根据“免疫记忆”可迅速进行免疫应答反应。

DC 在抗感染免疫中的作用十分独特，其既是固有免疫的第一道防线(识别、吞噬)，又是获得性免疫的始动者(对不同免疫方向的诱导)，主要诱导CD4+T(Th1、Th2)和CD8+T 淋巴细胞的活化［10-12］。机体抗白念珠菌的免疫机制包括固有免疫和获得性免疫，因此，应选择既能诱导细胞免疫又能诱导体液免疫的物质作为候选疫苗。本项目中实验组与对照组的生存期有显著性差异，说明DC 在抵抗系统性白假丝酵母菌感染发挥着重要的作用，这与小鼠肾病理切片观察结果相符，即DC 能有效保护白假丝酵母菌对小鼠肾小球的损伤。CD4+T 细胞是MHCⅡ类抗原限制的细胞群，CD8+T 细胞是MHCⅠ类抗原限制的细胞群。无论CD4+还是CD8+T 细胞均具有增强T 淋巴细胞免疫功能。实验组与对照组CD4+、CD8+相比均显著性升高，说明致敏的DC对系统性白假丝酵母菌感染诱发了有效而足够的保护性免疫反应。与自然免疫比较，体外抗原致敏后的人工过继免疫能避免抗原与抗原提呈细胞相遇机遇小、诱发免疫的方向难以控制的不足。

根据CD4+Th 细胞分泌细胞因子的类型，可分为Th1 和Th2 两个亚群。CD4+Th 通过分泌细胞因子，移动和活化效应细胞和分子。在系统性真菌感染中T 淋巴辅助细胞1(Th1)类因子如白细胞介素(IL-12)、干扰素α(IFN-α)介导的细胞免疫对机体起保护作用，而Th2 类细胞因子如IL-4、IL-10 等可削弱小鼠抗系统性真菌感染的能力［13］。IFN-α 既可作为前炎因子诱导IL-12 的分泌，促进Th0 细胞向Th1 细胞的定向分化;又可作为效应因子，活化巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞，促进单核细胞的循环，是机体抗白念珠菌感染的保护性因子。在本实验中IFN-α 水平的高低是致敏DC 诱导小鼠抗系统性白假丝酵母菌免疫的重要指标，IL-4 的水平作为小鼠白念珠菌感染非保护性免疫的指标。结果显示致敏DC 组IFN-α 含量较菌丝相组及对照组明显增高，IL-4 含量变化则与之相反。再次证明了致敏DC 对系统性白假丝酵母菌感染的免疫保护价值。有理由相信随着相关研究的不断深入，DC 疫苗或以DC 为佐剂将会在抗白假丝酵母菌感染免疫中起到越来越重要的作用。

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