白簕叶黄酮的提取纯化及其抗炎作用初探

杨慧文，张旭红，梁嘉君，潘育方

（广东药学院药科学院，广东广州510008）

白簕叶黄酮的提取纯化及其抗炎作用初探

杨慧文，张旭红，梁嘉君，潘育方*

（广东药学院药科学院，广东广州510008）

研究了白簕叶黄酮的提取纯化及抗炎效果。实验采用正交设计法优化了超声辅助提取法提取白簕叶黄酮，并考察了大孔树脂的纯化效果。采用50只SD大鼠，分为阴性对照组、地塞米松阳性对照组、白簕叶黄酮低、中、高剂量组，灌胃给药7d，末次给药后1h，分别测定大鼠足肿胀度，考察各组用药对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响。结果显示，采用最优方案提取白簕叶黄酮并进行纯化，所得提取液中总黄酮含量为37.01mg/g，纯化后黄酮纯度达到24.36%。将SD大鼠连续给药7d后，白簕黄酮提取物10、20、40mg/（kg·d）均能有效抑制角叉菜胶致大鼠足趾肿胀程度。研究结果表明，白簕叶黄酮具有抗炎效果，进一步开发了白簕的药用价值。

白簕，总黄酮，超声辅助提取法，大孔树脂纯化，抗炎

白簕（Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.）为五加科五加属的植物，又名鹅掌簕、禾掌簕、三加皮、三叶五加等，在我国大陆多分布于中南部各省。白簕的根、根皮、茎、叶均可作为药材使用，具有清热解毒、祛风除湿、散瘀止痛、止咳平喘等功效[1-2]。据研究，白簕含有皂苷、三萜羧酸、黄酮、糖苷等，化学成分丰富[3-6]，其植物黄酮经过大量国内外研究证明具有良好的抗氧化抗菌作用[7-8]，而对其抗炎作用却鲜有研究。炎症是指具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。炎症与许多疾病的发生、发展和治愈的过程密切相关。自从百余年前，水杨酸钠被应用于临床发挥抗炎作用以来，非甾体抗炎药得到了不断地改进发展，但对胃肠道的损伤始终是其最常见且最严重的不良反应之一[9]。植物药物常具有高活性、低毒性的特点，因此，寻找临床有效的植物抗炎药物具有重要意义。本实验研究白簕叶黄酮的抗炎作用，有利于白簕的进一步开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白簕叶（经广东药学院中药学院中药资源系刘基柱副教授鉴定为五加属植物白簕，标本保存于广东药学院中药学院标本室） 购自恩平响山簕菜茶厂；HPD-600大孔树脂 沧州宝恩吸附材料科技有限公司；芦丁标准品 中山优诺生物科技发展有限公司，批号11040302；角叉菜胶 广东药学院药科学院谭毓治教授馈赠；地塞米松 天津天药药业股份有限公司，国药准字H12020686；硫酸、无水乙醇、无水乙醚、丙酮、苯酚、正丁醇、甲醛等 均为分析纯；SD大鼠，体重180～200g，雌雄各半 广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证：SCXK（粤）2008-0020，粤监证字2008A003。

YLS-7B大鼠足趾容积测量仪 上海软隆科技发展有限公司；HH-2恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；LD4-2A离心机 北京医用离心机厂；DL-360A超声仪 上海之信仪器有限公司；UV-1200紫外可见光分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；注射器广东康尔美医疗器械有限公司，规格：1mL；烘箱ShanghaiBoxun；BL-220H电子天平 Shimadzu Corporatzon Japan；FA2104A万分之一天平 上海精天电子仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白簕叶的预处理 将烘干的白簕鲜叶粉碎过60目筛，称取约200g白簕叶细粉于1000mL锥形瓶中，并加入500mL石油醚，于30℃恒温搅拌，待上层提取液颜色较深时进行抽滤；更新溶剂，如此反复少量多次浸提至提取液几近无色；把溶剂倾去，样品置于通风处自然挥干溶剂至无醚味，得到脱色素后的白簕叶粉末，备用。

1.2.2 白簕叶黄酮的提取正交优化 称取9份白簕叶粉末，每份各2.0g，采用超声辅助提取法（超声功率250W）提取白簕叶总黄酮，以芦丁为对照品做含量测定指标。以总黄酮含量为测定指标，优化提取工艺。根据白簕叶黄酮的性质，选择乙醇浓度、超声时间、固液比和超声次数作为四个考察因素[10]，每个因素设定三个水平，按L9（34）表做正交实验，正交实验因素水平表见表1。

表1 正交实验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 芦丁标准曲线及回归方程的建立

1.2.3.1 芦丁标准品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的芦丁标准品10mg于10mL容量瓶中，加适量70%乙醇，超声波振荡使溶解，再加70%乙醇定容到10mL，充分摇匀，即得1.00mg/mL的芦丁标准溶液。1.2.3.2 最大吸收波长的确定 取1.2.3.1项下芦丁标准溶液于1cm比色皿中，以70%乙醇作为空白对照，在200～400nm间进行全波长扫描。

1.2.3.3 标准曲线的制备 精密量取1.2.3.1项下的标准溶液60、100、150、180、200μL于1～6号10mL容量瓶中，用70%乙醇定容到10mL，得到0.006、0.01、0.015、0.018、0.02mg/mL的芦丁对照品溶液，采用紫外分光光度法在265.5nm处测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标，浓度C（mg/mL）为横坐标，以最小二乘法做线性回归，即可得芦丁的标准曲线[11]。

1.2.4 白簕叶总黄酮含量测定 用移液管准确吸取一定体积的总黄酮提取液于容量瓶中，按一定的稀释倍数进行稀释，在λ=265.5nm处，测定吸光度A，根据公式（1）求出总黄酮含量[11]。

式中，Y—提取液总黄酮含量，mg/g；C—根据标准曲线得出的供试品溶液质量浓度，mg/mL；V—定容体，mL；M—稀释倍数；W—所用药材质量，g。

1.2.5 白簕叶总黄酮的纯化

1.2.5.1 HPD-600大孔树脂柱的预处理 用95%乙醇浸泡HPD-600大孔树脂24h以上，进行活化；取经预处理的HPD-600大孔树脂约20g湿法装柱，上柱前用去离子水洗去大部分乙醇后，采用去离子水湿法装柱，装好后去离子水冲洗至无醇味，且树脂床沉降均匀，无气泡。

1.2.5.2 上样吸附与洗脱 用去离子水配制1.5mg/mL的上样液，上样速度为1mL/min，收集泄露黄酮，上样吸附10h；接着，用4倍柱体积的去离子水洗脱至洗脱液无色；再用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集该洗脱液并测定吸光度，计算洗脱液中总黄酮浓度[12]。

1.2.5.3 白簕叶总黄酮纯化效果考察 取白簕总黄酮提取液、总黄酮纯化洗脱液各100mL，用70%乙醇稀释100倍，按照1.2.4方法测定总黄酮含量；将溶液旋转蒸发仪浓缩，真空干燥，得粗制黄酮粉、纯化黄酮粉，分别测定烘干后固体粉末的质量，求出黄酮纯度。

1.2.7 对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响 取体重为180～200g的SD雄性大鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别为阴性对照组、阳性对照组（地塞米松5mg/（kg·d））、白簕叶黄酮低、中、高剂量组（10、20、40mg/（kg·d）），每天灌胃给药1次，阴性对照组给予同体积生理盐水，连续7d，每天观察大鼠的体重、进食、饮水及活动状态。

实验方法参照文献[13]，实验前，用记号笔在每只大鼠左后足趾同一部位做清晰标记，并测定大鼠该标记处的正常足容积。各组末次给药后1h，自左足趾标记处皮下注射1%角叉菜胶0.1mL。致敏后分别于1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、12.0h测定大鼠足容积。按公式（3），计算致炎前后足容积之差即得肿胀度，比较给药组和对照组的差异情况。按公式（4），计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

根据1.2.3.2项下方法，全波长扫描结果显示，芦丁标准溶液在λ=265.5nm处有最大吸收峰，因此白簕黄酮含量测定波长定为265.5nm。所得标准曲线为A= 37.242C+0.0219，r=0.9997，式中，A—供试品溶液总黄酮吸光度；C—供试品溶液总黄酮浓度，mg/mL；r—相关系数。r=0.9997，表明芦丁标准曲线在0.006～ 0.020mg/mL浓度范围内线性良好。以芦丁为对照品，测定白簕叶总黄酮含量。

2.2 白簕叶总黄酮提取正交实验

按照1.2.2项下L9（34）表条件提取白簕叶总黄酮，以总黄酮含量为指标。根据实验结果进行分析，实验结果如表2、表3所示。

由表3、表4结果可见，四个考察因素中，固液比对提取液的总黄酮含量有影响，固液比越大，黄酮含量越高。影响黄酮含量的主次顺序依次为：固液比＞提取次数＞乙醇浓度＞超声时间，由于超声时间对总黄酮含量影响很小，因此根据经济有效的原则，超声时间选为10min。由此得到各因素的最佳搭配为B3A2D2C1，即最佳工艺为固液比1∶40，乙醇浓度70%，间歇超声2次，每次10min。

表2 L9（34）正交实验结果Table 2 Results of the orthogonal experiments L9（34）

表3 方差分析表Table 3 Analyze of deviation square

表4 HPD-600大孔树脂对白簕总黄酮的纯化富集效果Table 4 The purification effect of HPD-600 macroporous resin on total flavoniods from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr

表5 白簕黄酮对角叉菜胶致大鼠足趾炎症的影响（±s，n=10）Table 5 Effect of total flavoniods from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr on carrageenan-induced foot edema in rats（±s，n=10）

表5 白簕黄酮对角叉菜胶致大鼠足趾炎症的影响（±s，n=10）Table 5 Effect of total flavoniods from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr on carrageenan-induced foot edema in rats（±s，n=10）

注：与阴性对照组相比*p<0.05，**p<0.01。

致炎后不同时间的足趾肿胀度（mL）1h 2h 2.5h 3h 4h 5h 6h 12h阴性对照组 1.37±0.25 1.03±0.22 0.87±0.15 0.77±0.25 0.71±0.31 0.66±0.28 0.62±0.27 0.63±0.23 0.53±0.23低剂量 1.32±0.06 0.31±0.12** 0.44±0.16** 0.43±0.07* 0.46±0.09* 0.42±0.08* 0.35±0.10* 0.30±0.12** 0.16±0.07**中剂量 1.29±0.17 0.18±0.05** 0.34±0.12** 0.34±0.14** 0.33±0.11* 0.26±0.13* 0.23±0.14* 0.22±0.13** 0.073±0.16**高剂量 1.34±0.14 0.16±0.09** 0.29±0.08** 0.25±0.15** 0.25±0.17* 0.21±0.11* 0.13±0.04** 0.10±0.04** 0.015±0.01**地塞米松 1.26±0.07 0.08±0.01** 0.08±0.08** 0.14±0.06** 0.07±0.05** 0.04±0.02** 0.05±0.03** 0.04±0.01** 0.007±0.01**组别 V（致炎前足体积）（mL）

按照正交结果最优方案，称取5份白簕叶粉末各10.0g进行提取，计算总黄酮含量，该方法提取总黄酮含量均值为37.01mg/g，且实验结果稳定，RSD=1.70%，表明该优化工艺条件稳定。

2.3 白簕叶总黄酮纯化效果

白簕叶总黄酮提取液经大孔树脂纯化后，测定其总黄酮含量及黄酮质量分数，得结果见表4。

由表4可知，粗提液烘干得到干粉中黄酮质量分数为13.18%，纯化后质量分数提高为24.36%，表明HPD-600大孔树脂对于白簕叶总黄酮有较好的纯化富集效果。

2.4 对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响

2.4.1 一般状况及体重 通过7d的持续观察，实验发现各组大鼠的体重均正常增加，且活动敏捷，毛色有光泽。说明给药未对大鼠一般状况产生影响。

2.4.2 肿胀度的测定结果 取体重为180～220g的SD大鼠灌胃给药7d，于最后一次给药后1h，进行角叉菜胶致大鼠足趾肿胀实验，结果见表5。

由表5结果可见，白簕黄酮各剂量组均能显著抑制角叉菜胶所致大鼠的足肿胀度（p＜0.05）；与阴性对照组相比，白簕黄酮提取物低、中、高剂量组对角叉菜引起的炎症肿胀均有明显的抑制作用；提取物各浓度间比较可得，该抑制作用具量效关系，剂量越大，抑制作用越强。

在大鼠炎症模型中，角叉菜胶致炎后1h，阴性对照组大鼠右后足趾开始出现急性炎症样红、肿等变化，1h作用最为明显，肿胀度达（1.03±0.22）mL，后逐渐消肿，持续达12h以上，足体积在12h由正常值（1.37±0.25）mL增至（1.89±0.07）mL。白簕黄酮各剂量组于致炎1h后即发挥极显著抗炎功效（p＜0.01）。以白簕黄酮在致炎作用6h时为例，各组剂量均能显著抑制大鼠足趾肿胀，白簕黄酮低、中、高剂量组的抑制率分别为52%、65%、82%。

3 讨论

现代药理学研究显示，植物提取物具有广泛的药理作用，常具有免疫调节、抑菌消炎、抗癌防癌等诸多生理活性。据报道白簕具有清热解毒、祛风除湿、散瘀止痛的效果[14-15]，因此本实验针对白簕的主要成分之一白簕叶黄酮，展开了抗炎作用的研究。

本实验中，以角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型作为评价天然产物抗炎作用的炎症模型。研究发现，角叉菜胶诱导大鼠足趾肿胀可能与前列腺素（PGE2）有关[16]。PGE2是抗炎药物在临床上作用靶点中最有效且最敏感的物质。本研究中，白簕黄酮提取物能显著抑制角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀，提示抑制肿胀可能与抑制炎症介质PGE2的释放有关。

目前临床上常用的抗炎药分为甾体和非甾体两类，疗效虽好，但均具有较多不良反应，其中最常见的为胃肠道反应和肝肾毒性等[17]。因此寻找更好的抗炎药势在必行。近年来大量的研究表明，中草药提取物黄酮类化合物多具有抗炎作用，中草药具有毒副作用较小的特点，白簕是一种资源丰富、价格低廉的草药，且本实验结果显示，其黄酮类化合物可降低角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的程度，因此对白簕黄酮类化合物的抗炎药理研究具有一定意义，有较好的开发前景。

4 结论

采用正交设计法优化超声辅助提取法提取白簕叶黄酮，并考察了大孔树脂的纯化效果。结果显示，提取最优工艺为固液比1∶40，乙醇浓度70%，间歇超声2次，每次10min。该方法所得提取液中总黄酮含量为37.01mg/g，纯化后黄酮纯度达到24.36%。

通过研究了白簕叶黄酮对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型的抑制能力得出，连续给药7d后，白簕叶黄酮提取物10、20、40mg/（kg·d）均能有效抑制角叉菜胶致大鼠足趾肿胀程度。该结果表明白簕叶黄酮具有抗炎效果，本实验有助于进一步开发白簕的药理功效。

[1]江苏新药学院.中药大辞典[M].上海：上海人民卫生出版社，1977.

[2]朱立新．中国野生蔬菜开发与利用[M].第1版.北京：金盾出版社，1996.

[3]杜江，高林.白簕叶的化学成分研究[J].中国中药杂志，1992，17（6）：356-357，383.

[4]Kiem PV，Minh CV，Cai XF，et al.A new 24-nor-lupaneglycoside of Acanthopanax trifoliatus[J].Arch Pharm Res，2003，26（9）：706-708.

[5]Gao X，Li YX，Cai LY，et al.Studies on purification of total saponins from the leaves ofAcanthopanax trifoliatus by macroporous adsorption resin[J].Zhong Yao Cai，2009，32（5）：780-784.

[6]Yook C S，Kim IH，Hahn DR，et al.Lupane-triterpene carboxylic acids from the leaves of Acanthopanax trifoliatus[J]. Phytochemistry，1998，49（3）：839-843.

[7]肖杭，黎云祥，蔡凌云，等.白簕叶总黄酮的提取和纯化及其抑菌实验初探[J].光谱实验室，2010，27（6）：2130-2134.

[8]肖杭，黎云祥，蔡凌云.白簕叶总黄酮的体外抗氧化活性研究[J].西华师范大学学报：自然科学版，2011，32（2）：156-160，170.

[9]Singh G，Triadafilopoulos G.Epidemiology of NSAID induced gastrointestinal complications[J].J Rheumatol，1999，26（Suppl 56）：18-24.

[10]肖杭，黎云祥，蔡凌云，等.超声辅助法提取白簕茎皮总黄酮的工艺研究[J].光谱实验室，2010，27（1）：197-201.

[11]张进棠，姚本林，刘伏煌，等.银杏叶提取物中总黄酮的紫外分光光度测定[J].武汉化工学院学报，1998（1）：27-29.

[12]邵盈盈，李向荣.大孔树脂纯化蓝莓总黄酮及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2013，34（7）：73-76.

[13]陈艳芬，江涛，唐春萍，等.高良姜总黄酮抗炎镇痛作用的实验研究[J].广东药学院学报，2009，25（2）：188-191.

[14]张秋燕，张福平．野生保健蔬菜—白簕[J].食品研究与开发，2003，24（3）：66-67．

[15]刘基柱，严寒静，房志坚.白簕叶中挥发油成分分析[J].河南中医，2009，29（5）：505-506.

[16]肖百全，朱少璇，杨威，等.角叉菜胶致大鼠足肿胀模型探讨及其机制研究[J].中国实用医药，2008，23（3）：63-65.

[17]姚中强，于孟学，韩淑玲.非甾体抗炎药[J].北京医学，2005，27（5）：295-300.

Research of extraction，purification and anti-inflammatory effect of total flavonoids from Acanthopanax Trifoliatus（Linn.）Merr.leaves

YANG Hui-wen，ZHANG Xu-hong，LIANG Jia-jun，PAN Yu-fang*
（Guangdong Pharmaceutical University，College of Pharmacy，Guangzhou 510008，China）

To study the extraction，purification and anti-inflammatory effect of total flavonoids from Acanthopananx Trifoliatus（L.）Merr.leaves，the orthogonal test was carried out to optimize the ultrasonic-assisted extraction method.50 rats were divided into normal group，negative control group，positive control group，flavonoid lowdose group，flavonoid mid-dose group and flavonoid high-dose group.7d after dosing by intra-peritoneal injection，carrageenan-induced hind paw edema in rats were conducted to investigate the anti-inflammatory effect.The content of total flavonoids in extraction with the optimized protocol was 37.01mg/g，and purity was up to 24.36%after purification.Total flavonoids at dose of 10，20，40mg/（kg·d）could inhibite swelling induced by carrageenan.Results showed that total flavonoids from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.leaves had anti-inflammatory effect，which further develop the medicinal value of Acanthopanax Trifoliatus（Linn.）Merr.

Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.；total flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；macroporous adsorption resins；anti-inflammatory effect

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0295-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.058

2013－06－17 *通讯联系人

杨慧文（1983-），女，硕士研究生，实验师，主要从事药学及新药开发方面的研究。