扇贝贝肉抗氧化肽制备及体外抗氧化实验研究

刘 媛，王 健，牟建楼，孙剑峰，魏 巍，王 颉，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；2.河北北方学院食品科学系，河北张家口075000）

扇贝贝肉抗氧化肽制备及体外抗氧化实验研究

刘 媛1，2，王 健2，牟建楼1，孙剑峰1，魏 巍1，王 颉1，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；2.河北北方学院食品科学系，河北张家口075000）

以海湾扇贝和虾夷扇贝的贝肉为原料，研究扇贝品种、蛋白酶种类、加酶量、固液比、酶解温度对水解度及体外自由基清除率的影响。在单因素实验的基础上采用L9（34）正交实验，对酶解条件进行优化研究。结果表明，最佳酶解条件为：以海湾扇贝为原料，选用中性蛋白酶，加酶量3.25%（[E]/[S]），酶解温度40℃，固液比1∶2.5（W/V），此时水解度可达45.91%，DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为91.90%和79.72%。

扇贝，抗氧化肽，超氧阴离子，DPPH自由基

鉴于陆生资源的匮乏，近年来从海洋生物中寻找新的活性物质日益受到人们的重视。在海洋贝类中越来越多的生理活性物质正被逐步发现，扇贝多肽（polypeptide from chlamys farreri，PCF）是首次从海洋生物栉孔扇贝（chlamys farreri）中提取得到的水溶性多肽，以往体外细胞研究发现，PCF能有效地清除化学体系产生的氧自由基[1]；能够抑制UVA对HeLa上皮细胞的氧化损伤[2]；抑制UVB对成纤维细胞的氧化损伤[3]；可明显减轻UVA、UVB对昆明种无毛小鼠皮肤的损伤作用[4]；可提高免疫细胞活性，减轻胸腺细胞的氧化损伤、抑制胸腺细胞的凋亡[5]，对紫外线及60Co辐射损伤的免疫细胞有保护作用[6-7]等。因此作为新一代天然抗氧化添加剂，其开发利用的价值非常广阔。

目前，国内外研究人员已从花生[8]、猪皮[9]等原料中提取到抗氧化肽[10]，但多集中于陆生动植物原料，而对具有独特结构和功能的海洋生物原料的研究报道较少。本研究以扇贝为原料，采用商品蛋白酶酶解制备扇贝抗氧化肽。在筛选实验和单因素实验基础上，采用正交实验优化了制备扇贝抗氧化肽的酶解条件，并对所得的抗氧化肽进行了体外抗氧化研究，旨在为深入研究扇贝中抗氧化肽的性质及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海湾扇贝和虾夷扇贝 河北农业大学科技市场；木瓜蛋白酶（＞50万U/g）、中性蛋白酶（＞6000U/g） 北京奥博星生物技术有限公司；碱性蛋白酶（＞10万U/g） Biotopped；基准级邻苯二甲酸氢钾 天津市福晨化学试剂厂。

DFT-200C200克快速开盖万能高速粉碎机 上海比朗仪器有限公司制造；pHS-3C实验室酸度计 上海洛奇特电子设备有限公司；HH-2电热恒温水浴锅 上海比朗仪器有限公司；79-1磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；GL-20B冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂制造；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；UV-2800型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司。

1.2 扇贝贝肉抗氧化肽制备工艺流程

新鲜扇贝→去除内脏→清洗→绞成肉糜→按比例加水匀浆→调最佳pH→按不同加酶量、温度恒温酶解4h→沸水浴灭酶10min→冷却后离心10000r/min，30min→取上清液→抗氧化肽。

反应过程中以1mol/L的NaOH标准溶液调节酶解液pH。

1.3 扇贝品种及蛋白酶种类的筛选实验

称取海湾扇贝和虾夷扇贝肉糜（固液比1∶5）各3份，按[E]/[S]=1.2%分别加入三种酶，并调节水温和pH（碱性蛋白酶45℃，pH10.5；中性蛋白酶40℃，pH7.5；木瓜蛋白酶57℃，pH7.5），均保温水解4h，测定抗氧化肽的水解度及自由基清除率，筛选出扇贝品种和蛋白酶种类。

1.4 酶解条件的单因素实验

1.4.1 酶添加量对水解度及自由基清除率的影响 称取扇贝肉糜（固液比1∶5）8份，分别按酶添加量（[E]/[S]）0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的比例加入筛选出的中性蛋白酶，调节水解温度为40℃，pH为7.5，保温水解4h，测定抗氧化肽的水解度及自由基清除率。

1.4.2 固液比对水解度及自由基清除率的影响 称取扇贝肉糜8份，分别按照固液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8加水匀浆，按筛选出的酶添加量3.0%加入中性蛋白酶，调节水解温度为40℃，pH为7.5，保温水解4h，测定抗氧化肽的水解度及自由基清除率。

1.4.3 温度对水解度及自由基清除率的影响 称取扇贝肉糜5份（均按筛选出的固液比1∶3和酶添加量3.0%），分别在25、30、35、40、45℃水解温度下，调节pH为7.5，保温水解4h，测定抗氧化肽的水解度及自由基清除率。

1.5 酶解工艺条件的正交实验设计

根据L9（34）正交实验设计原理，以水解度为指标，选取酶添加量、固液比与温度为影响因素，进行三因素三水平实验设计，具体反应因素、水平如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.6 水解度（DH）的测定

总氮含量：样品中总氮含量的测定采用凯氏定氮法[11]

氨态氮含量：采用GB/T 5009.39-2003甲醛值法进行测定.

水解度按照以下公式进行计算：

1.7 DPPH自由基清除率的测定

[12]并加以改进：在离心管中依次加入0.5mL样品，0.5mL蒸馏水，0.5mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀后在室温下避光反应20min，在517nm下测吸光值As，空白组为0.5mL无水乙醇代替DPPH溶液，测定吸光值为Ax；对照组为0.5mL蒸馏水代替样品，测定吸光值A0，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零，DPPH自由基清除率AOA按以下公式计算：

式中：AOA—自由基清除率；A0—对照组吸光值；As—样品组吸光值；Ax—空白组吸光值。

1.8 超氧阴离子自由基清除率的测定

参考文献[13]并加以改进：取0.05mol/L的Tris-HCl（pH8.2）缓冲液2.4mL，于25℃水浴预热20min，加入0.3mL预热过的4mmol/L的邻苯三酚溶液和0.3mL的不同浓度的样品溶液，混匀，25℃下反应4min，加一滴10mmol/L的HCl终止反应，在325nm处测定吸光度，重复三次，计算平均值。

O2-·清除率（%）=（A0-（As-Ax））/A0×100

式中，A0：不加样品溶液的吸光度；As：加入样品溶液反应后的吸光度；Ax：不加邻苯三酚溶液时样品溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 扇贝品种及蛋白酶种类的筛选

由表2可知，以海湾扇贝为原料，采用中性蛋白酶水解，所得到的抗氧化肽水解度最大，对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力最强。这可能与蛋白酶的种类及扇贝原料中氨基酸组成有关。

蛋白酶按照作用的位点不同可分为内肽酶和端肽酶，内肽酶主要作用蛋白质分子中间的肽键，端肽酶主要作用蛋白质分子的游离氨基或羧基末端，进而逐步降解氨基酸残基。本实验所选用的中性蛋白酶和碱性蛋白酶均为内肽酶，且中性蛋白酶水解的特异性较宽[14]，而木瓜蛋白酶在水解蛋白质时，主要发挥端肽酶的作用[15]。目前对各蛋白酶的切割位点进行研究的报道比较少，赵谋明等[16]采用高效液相色谱法推断中性蛋白酶和碱性蛋白酶对酪朊酸钠的切割位点，认为中性蛋白酶水解酪朊酸钠时，切割位点比较广，能对蛋白中的-Val、-Phe、-Cys、-Leu、-Tyr、-Trp、-Ile、-Lys、-Gly等氨基酸残基部位进行水解。此外，海湾扇贝与虾夷扇贝相比富含酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly）等氨基酸[17]，所以中性蛋白酶对海湾扇贝进行水解时具有比较强的水解能力。

2.2 单因素实验

2.2.1 酶添加量对水解度及自由基清除率的影响 由图1可知，酶添加量（[S]/[E]）在0.50%～4.0%时，水解度随着酶添加量的增加而缓慢升高，且在3.0%时达到最大值30.66%，继续提高酶用量，水解度又缓慢下降。因为一般在底物浓度饱和的情况下，增加酶的用量能提高酶解效率；而此次实验中的固液比为1∶5，明显未达饱和浓度，所以水解度呈先升高后下降的趋势。

表2 扇贝品种和蛋白酶种类对酶解效果影响Table 2 Effect of species of scallop and protease on enzymatic hydrolysis

图1 酶添加量对酶解效果的影响Fig.1 Effect of enzyme quantity on enzymatic hydrolysis

DPPH自由基的清除能力和超氧阴离子自由基的清除能力均随着酶添加量的增加逐渐增强，在3.0%时达到最大值，分别为89.75%和65.12%，继续提高酶用量，清除率又降低。这可能因为酶解产生的多肽具有清除自由基的活性，而随着酶解反应的进行活性多肽再次分解，从而失去清除能力。

2.2.2 固液比对水解度及自由基清除率的影响 由图2可知，固液比在1∶1～1∶8时，水解度呈急速升高又缓慢降低的趋势，在1∶3时达到最大值33.22%；DPPH自由基的清除率呈先降又升最后又降低的趋势，但变化不明显，固液比在1∶3时，达到最大值84.48%；超氧阴离子自由基的清除率变化幅度较大，固液比在1∶3时，清除率骤然升高，达到最大值，之后又迅速下降。因为最初底物浓度过高，过量的底物聚集在酶分子表面，形成另一种无活性的中间产物，抑制了蛋白酶解[18]；在固液比为1∶3时，底物浓度适中，利于其充分占据酶的活性中心，提高敏感肽键的数量，加快酶反应速率[19]，有利于获得具有清除自由基活性的目标产物；随着固液比的增大，底物浓度逐渐降低，酶解效率也逐渐下降。

2.2.3 温度对水解度及自由基清除率的影响 由图3可知，随着温度的升高，水解度和超氧阴离子自由基的清除能力均呈现先升高后降低的趋势，在40℃时，水解度最大，对两种自由基的清除能力最强，与相关研究报道相符。因为中性蛋白酶的最适作用温度为40℃，低于或高于此温度，酶活力及反应速率受到影响，自由基清除能力降低。

图2 固液比对酶解效果的影响Fig.2 Effect of the ratio of solid to liquid on enzymatic hydrolysis

图3 温度对酶解效果的影响Fig.3 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis

2.3 正交实验结果

正交实验的结果如表3所示，由极差分析结果可知，3个因素的极差由大到小依次为B＞C＞A，即固液比影响最大，其次为酶解温度，最后为酶添加量。根据K值大小可知最优组合为A3B1C2，即加酶量（[E]/[S]）3.25%，固液比（W/V）1∶2.5，酶解温度为40℃。在此基础上进行验证实验，3组平行实验测得水解度均值为45.91%，DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别平均为91.90%和79.72%，说明采用优化后的酶解工艺能获得较高自由基清除能力的抗氧化肽。

3 结论

通过比较扇贝品种及蛋白酶种类对所得抗氧化肽水解度及自由基清除能力的影响，选定海湾扇贝为原料，采用中性蛋白酶进行酶解；在单因素实验基础上，筛选出适宜的酶添加量（[E]/[S]）、固液比（W/V）和温度，利用L9（34）正交实验得到最佳酶解工艺为：酶添加量（[E]/[S]）3.25%，固液比1∶2.5（W/V），酶解温度40℃，在此条件下水解度可达45.91%，对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为91.90%和79.72%，说明所得扇贝抗氧化肽对DPPH自由基和超氧阴离子自由基具有较强的清除能力。

表3 L9（34）正交实验设计与结果Table 3 L9（34）orthogonal design and results

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Study on preparation and the antioxidant effect of antioxidant peptide from scallop protein

LIU Yuan1，2，WANG Jian2，MU Jian-lou1，SUN Jian-feng1，WEI Wei1，WANG Jie1，*
（1.College of Food Science and Technology，Agriculture University of Hebei，Baoding 071000，China；2.Department of Food Science，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

With Bay scallop and Japanese scallop as raw material，effects of species of scallop and enzyme，enzyme quantity，temperature and the ratio of solid to liquid on the degree of hydrolysis（DH）and free radical scavenging activity were studied.On the basis of single factor experiment，orthogonal experiment of L9（34）was used to optimize the technical parameters.Results indicated that the optimal hydrolytic conditions were as follows：using Bay scallop as the material，enzyme quantity of the neutral protease 3.25%（[E]/[S]），temperature 40℃，the ratio of solid to liquid 1∶2.5.The DH was 45.91%，and the scavenging rate of DPPH radical and superoxide anion radical were 91.90%and 79.72%.

scallop；antioxidant peptide；superoxide anion；DPPH radical

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0206-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.038

2013－09－16 *通讯联系人

刘媛（1981-），女，在读博士，讲师，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

国家海洋局公益性行业科研专项（201205031）；河北省科技计划项目（14273205D）。