两株粪肠球菌的安全性评价

王雪芹，林海君，鞠世影，霍贵成（东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030）

两株粪肠球菌的安全性评价

王雪芹，林海君，鞠世影，霍贵成*（东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030）

乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是两株分离于传统乳制品的粪肠球菌，这两株菌均会产生高效抗李斯特菌的细菌素，而且产生的细菌素具有良好的加工稳定性。本实验主要是评价这两株菌的安全性，为其实际应用提供可靠的理论依据。通过对两株菌的耐药性、有害代谢产物、机体指标、急性毒理实验以及溶血性和易位实验得到：急性毒理实验中，动物的体重变化正常而且主要脏器无异常；两株菌对大部分常见的抗生素都没有耐药性，只是对庆大霉素具有抗性，不含有可转移的质粒；而且菌株的生长代谢过程中不会产生硝基还原酶、胆盐羧化酶和氨基脱羧酶；谷胱甘肽和丙二醛含量基本正常，不会产生溶血和易位现象。通过对两株菌的安全性评价可知乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是安全的。

粪肠球菌，安全性，耐药性，机体指标

乳酸菌是一群能使可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称[1]，乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、增强机体免疫、促进营养物质吸收和益生等功能，所以广泛应用于乳制品、保健品和添加剂中而被人们所消费。通常使用的乳酸菌被认为是人体肠道的重要菌群，对人体是无害的[2]，但是乳酸菌的安全问题仍不容忽视，尤其是一些没有长时间安全使用历史的新开发菌株，应确保其安全性再投入到实际应用中。

现阶段，我国还没有完善的乳酸菌及其产品的安全性评价方法和体系，一般都是从耐药性评价、有害代谢产物评价和动物性实验几个方面进行菌株的安全性评估[3]。本实验的两株乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611均分离于传统的乳制品中，通过电镜观察和16SrDNA的鉴定，两株均为粪肠球菌[4]。KLDS6.0610和KLDS6.0611是两株高产高效抗李斯特菌细菌素的乳酸菌，而且产生的细菌素有良好的加工稳定性，具有潜在的应用价值和前景[4]。本实验对两株粪肠球菌进行耐药性实验、机体指标和有害代谢产物的评价实验以及急性毒理实验，评价这两株菌的安全性，为其以后的实际应用提供理论的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611 由乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心（KLDSDICC）提供；清洁级昆明雄性小鼠 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号scxk2011-027，平均体重为12～16g；BASM培养基 配方见文献[5]；MRS培养基 配方见文献[4]；蛋白胨、酵母膏、多价胨、牛肉膏、胰蛋白胨、北京奥博星；琼脂糖、葡萄糖、吐温80、氯化钠 北京博奥拓达；酪氨酸、组氨酸、赖氨酸 天津TBD公司；药敏纸片 杭州微生物试剂有限公司；质粒提取试剂盒、丙二醛测定试剂盒，BCA蛋白质测定试剂盒 碧云天试剂有限公司；硝基还原酶测试盒、还原型谷胱甘肽检测试剂盒 南京建成试剂有限公司。

电热恒温培养箱DHP-9272 上海-恒科技有限公司；全自动高压灭菌锅HVE-50HIRAYAMA；DK-98-11A电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱DH-101-3BS 天津市中环实验电炉有限公司；快速混匀器XK96-A、匀浆器 姜堰市新康医疗器械有限公司；紫外分光光度仪、酶标仪 美国Beckman公司；洁净工作台VD-1320 北京东联哈尔仪器制造有限公司；低速离心机LD4-2 北京医用离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 耐药性评价实验

1.2.1.1 药敏片实验 采用药敏片琼脂扩散法[6]。将待测菌液培养过夜，取100μL待试菌液均匀涂布于MRS固体培养基中，菌液完全被吸收后，然后把药敏片放入每个MRS培养基中，所用的药敏片分别为：万古霉素、卡那霉素、四环素、氨苄青霉素、氯霉素、青霉素和庆大霉素。静置20min后，放入37℃培养箱中倒置培养，24h后测量各药敏片的抑菌圈大小。

1.2.1.2 质粒提取实验 取1.5mL培养14h的实验菌液，用质粒提取试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取菌液的基因组DNA。将0.5g琼脂糖溶解于100mL的1×TAE电泳缓冲液中，冷却至室温，并向其中加入0.5μL溴乙锭，倒入电泳槽中制备电泳所用的胶。将4μL提取完质粒的液体与2μL的6×Buffer混合，向琼脂糖凝胶中点样。电压为150V，工作时间为20min。电泳液为1×TAE溶液，电泳结束后，使用凝胶成像仪进行观察。

1.2.2 有害代谢产物评价实验

1.2.2.1 硝基还原酶检测实验 将培养14h的实验菌液3000r/min离心20min，吸取上层清液，使用硝基还原酶测试盒测定待测菌液中硝基还原酶的浓度。硝基还原酶检测方法各管试剂添加顺序见表1，添加完成后混匀，3500r/min离心10min，取上清，于540nm处测定吸光值。

表1 硝基还原酶检测方法Table 1 The test method of nitrate reductase

1.2.2.2 氨基脱羧酶活性检测实验 使用涡旋混匀器将过夜培养的实验菌液混合均匀，取100μL菌液均匀涂布于BASM培养基中，菌液完全吸收后，放入37℃培养箱中倒置培养，24h后观察菌落周围是否有颜色变化。

1.2.3 动物实验

1.2.3.1 适应性喂养 在环境为20℃，湿度为50%，光照12h的条件下，给予足够的食物和纯净水进行喂养3～5d。

1.2.3.2 急性毒理实验 将结束了适应性喂养的清洁级昆明雄性小鼠随机分成四组，每组5只。分别编号为KLDS6.0610对照组、KLDS6.0610实验组、KLDS6.0611对照组和KLDS6.0611实验组。将过夜培养的菌液浓度调至109cfu/0.2mL 0.9%NaCl溶液，灌胃开始前16h禁食，但不限制饮水。按每只0.2mL/10g体重的剂量进行灌胃，一日三次，每次间隔2～3h。灌胃结束后，观察7日内小鼠的活动状态和体重变化，第8d将全部的小鼠用颈椎脱臼法处死，观察主要器官的变化。

1.2.4 主要机体指标评价实验

1.2.4.1 丙二醛血清（MDA）浓度检测实验和肝总谷胱甘肽（GSH）浓度检测实验 将结束了适应性喂养的20只昆明雄性小鼠随机分成4组，每组5只。别为KLDS6.0610对照组、KLDS6.0610实验组、KLDS6.0611对照组和KLDS6.0611实验组。实验组的菌液浓度为109cfu/0.2mL 0.9%NaCl溶液，对照组使用0.9%NaCl溶液进行灌胃，剂量均为0.2mL/10g，每天一次，连续20d。在第21d时，对全部的小鼠进行眼球取血，3000r/min离心20min，吸取上层清液，使用丙二醛测定试剂盒进行丙二醛含量的测定。同时，将小鼠处死，称取0.1g肝脏溶于1mL 0.9%NaCl溶液中，在冰水浴的条件下进匀浆，然后3000r/min离心20min，吸取上层清液，使用BCA蛋白质试剂盒和谷胱甘肽浓度检测试剂盒检测肝总谷胱甘肽的浓度。

1.2.4.2 胆盐羧化酶活性的检测 普通的MRS固体培养基中加入5g牛黄脱氧胆酸钠盐，121℃15min灭菌后，倾倒于平板中，将待测菌液均匀涂布于平板中，放入37℃培养箱中，24h后观察是否有白色沉淀产生。

1.2.5 其他评价实验

1.2.5.1 溶血实验 菌株KLDS6.0610和KLDS6.0611在MRS中37℃培养14h，然后转移到血琼脂基质平板上。平板在37℃培养14h。通过观察菌落周围是否有清晰的溶菌圈，记录溶血反应结果。

1.2.5.2 易位实验 将结束了适应性喂养的20只昆明雄性小鼠随机分成4组，每组5只。分别为KLDS6.0610对照组、KLDS6.0610实验组、KLDS6.0611对照组和KLDS6.0611实验组。实验组的菌液浓度为109cfu/0.2mL 0.9%NaCl溶液，对照组使用0.9%NaCl溶液进行灌胃，剂量均为0.2mL/10g，每天一次，连续10d。每天记录小鼠的体重变化，在第11d，称取1g处死小鼠的心、肝、脾、肺、肾，并加入9mL的生理盐水在冰水浴的条件下进行匀浆，制备成10%的匀浆液。并将匀浆液均匀涂布于MRS培养基上，37℃倒置培养24h后，观察平板上是否有菌落生长。

1.3 数据处理

使用SPSS软件对数据进行差异性分析。数据的表示方式为：平均值±标准偏差。相同字母代表差异性不显著，不同字母代表差异性显著。

2 实验结果

2.1 耐药性评价实验

耐药性实验结果见表2。通过KLDS6.0610和KLDS6.0611对7种常见抗生素的敏感性实验可知，两株菌对大部分抗生素都很敏感，没有抗药性，但是对庆大霉素不敏感。琼脂糖凝胶电泳实验结果见图1，两株菌的泳道均没有条带，可以判定KLDS6.0610和KLDS6.0611都没有质粒存在。

表2 耐药性实验结果Table 2 The results of resistance test

图1 质粒提取的电泳图Fig.1 Electrophoregram of plasmid extractio

2.2 有害代谢产物评价实验

氨基脱羧酶检测实验结果见表3，两株菌均表现出阴性反应，可以认定KLDS6.0610和KLDS6.0611均不含有氨基脱羧酶。硝基还原酶浓度检测实验结果见表4，KLDS6.0610和KLDS6.0611中硝酸还原酶的浓度与对照组无显著差异性，所以可以判定两株菌中均没有硝基还原酶的存在。

表3 氨基脱羧酶检测结果Table 3 The detection results of amino acid decarboxylase

表4 硝基还原酶检测结果Table 4 The test results of nitrate reductase

2.3 急性毒理实验

灌胃结束的7d内，小鼠的活动正常，无异常行为，进食和饮水正常，皮毛正常，而且实验组的小鼠体重呈现正常的增长趋势，与对照组无显著差异性（见图2）。在第8d时对小鼠进行解刨，观察到实验组小鼠的心、肝、脾、肺、肾均无异常现象。

图2 动物的体重变化Fig.2 The weight change of animals

2.4 主要机体指标评价实验

在20d的灌胃期间内，没有小鼠出现死亡的现象，而且小鼠的进食、饮水和排便均正常，精神状态良好，活动正常，通过对实验组和对照组的小鼠体重进行差异性分析可知，实验组小鼠的体重也与对照组一样呈现正常增长趋势，无显著差异（见表5）。

GSH和MDA的检测结果见图3～图4。实验组的丙二醛浓度与对照组无显著差异（p＞0.05），而谷胱甘肽的含量显著高于对照组（p＜0.05）。将两株菌分别涂在含有牛黄脱氧胆酸耐盐的MRS上培养24h后发现没有白色沉淀产生，说明两株菌都不含有牛黄脱氧胆酸钠盐。

表5 动物的体重（g）变化结果（x±SD；n=5）Table 5 The results of weight（g）change of animals（x±SD；n=5）

图3 GSH的检测结果Fig.3 The detection results of content of GSH

图4 MDA的检测结果Fig.4 The detection results of content of MDA

2.5 其他评价实验

KLDS6.0610和KLDS6.0611均没有出现溶血现象，在易位实验的10d灌胃期间内，小鼠的体重无异常变化（见表6），而且处死小鼠的心、肝、脾、肺、肾匀浆处理后涂布在MRS培养基上过夜培养的结果显示：没有出现乳酸菌生长的现象，所以没有发生细菌的易位现象。

表6 易位实验动物体重（g）变化结果（x±SD；n=5）Table 6 The weight（g）change of animals translocation experiment（x±SD；n=5）

3 讨论

3.1 耐药性评价实验

近年来，随着抗生素的广泛使用，乳酸菌也不断出现耐药性的现象，特别是有些乳酸菌对万古霉素的耐药性为临床治疗带来了很大的困难[7]。乳酸菌的耐药性主要来自于两个原因：乳酸菌自身具有编码耐药性的基因，这个基因可能位于染色体上，也可能位于质粒上。或者是通过基因水平转移获得耐药因子，长期摄入具有耐药性的乳酸菌会对人的身体产生严重的危害[8]。

通过药敏实验可知：KLDS6.0610和KLDS6.0611均对万古霉素、卡那霉素、四环素、氨苄青霉素、氯霉素、青霉素很敏感，只是对庆大霉素具有抗性。说明两株菌有潜在的应用前景。在质粒检测实验中发现，两株菌均不含有质粒，这有可能是因为两株菌并不含有耐药基因，或者是耐药基因存在于染色体上，但是可以判定在这两种情况下，两株菌都不会通过基因水平转移将耐药基因转移，在实际应用中应该是安全。

3.2 机体指标评价实验

体重异常是引起各种疾病的一个异常前兆，在20d的灌胃期间内。实验组的小鼠体重增长正常，精神状态良好，无死亡现象。说明KLDS6.0610和KLDS6.0611的摄入不会引起小鼠体重的异常变化，降低各种疾病的发病率。

谷胱甘肽在动物的肝脏中含量较为丰富，具有保护肝脏的功能[9]，实验中发现实验组小鼠的谷胱甘肽含量略高于对照组，可能与败血症急性期有关系，但是，对机体没有明显的影响。脂质发生过氧化反应会产生丙二醛，丙二醛会引起蛋白质、核酸等大分子的交联，具有细胞毒性[9]。实验中检测到实验组与对照组的血清丙二醛浓度没有明显差异，说明KLDS6.0610和KLDS6.0611并没有增加脂类超氧化能力，避免了细胞毒性的产生。

3.3 有害代谢产物评价实验

硝基还原酶可以将人体内摄入的硝酸盐还原成亚硝酸盐，并在一定的条件下产生硝酸铵，对人体具有致癌变的危害[10]。氨基脱羧酶能够将食品中的氨基酸脱羧还原成生物胺类物质[11]，当体内积累过多的生物胺类物质时，机体会产生严重的中毒症状。KLDS6.0610和KLDS6.0611均不含有硝基还原酶和氨基脱羧酶，可以应用于实际生产中。

3.4 其他评价实验

溶血性细菌的侵入引起的溶血现象会导致败血症的发生，实验证实KLDS6.0610和KLDS6.0611不会引起溶血现象，对红细胞没有影响。细菌易位是肠道内的细菌越过肠粘膜屏障，出现在其他脏器的一种现象，这种肠道微生态被严重破坏后会对机体造成不良的影响，易位实验结果表明：KLDS6.0610和KLDS6.0611均不会在小鼠体内发生易位现象。

4 结论

通过对两株高产细菌素的粪肠球菌进行全面的安全性评价可知：两株菌对大部分常见的抗生素均无抗性，只是对庆大霉素有抗性，不含有可转移的质粒。不会产生硝基还原酶、胆盐羧化酶和氨基脱羧酶。急性毒理实验可知：实验组的动物体重与对照组无显著差异性，主要器官无异常变化。动物喂养实验可知：谷胱甘肽和丙二醛的含量基本正常，不会产生溶血和易位现象。所以，乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是安全的。

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Safe assessment of two Enterococcus faecalis

WANG Xue-qin，LIN Hai-jun，JU Shi-ying，HUO Gui-cheng*
（Northeast Agriculture University，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Harbin 150030，China）

Two Enterococcus faecalis coded as KLDS6.0610 and KLDS6.0611 were separated from traditional dairy.They could produce bacteriocins active against L.monocytogenes and had good stability in the processing.The objective of the present study was to evaluate the safety of the Enterococci.In the acute toxicology experiment，the weight changes of animals was normal.Two strains did not present multi-resistance to antibiotics and had no transferable plasmid.They did not produce nitrate reductase，bile acid carboxylase and amino acid decarboxylase.The content of GSH and MDA were normal.They had no hemolytic activity and translocation phenomenon.So，both KLDS6.0610 and KLDS6.0611 were safe.

Enterococci faecalis；safety；drug resistance；body index

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.029

2013－08－05 *通讯联系人

王雪芹（1989-），女，硕士研究生，研究方向：乳品科学与微生物。

国家“863”项目（2011AA100902）。