显齿蛇葡萄叶对食品防腐作用的研究

刘胜贵，张 静，王频艺，付 明

（怀化学院生命科学系，民族药作植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化418008）

显齿蛇葡萄叶对食品防腐作用的研究

刘胜贵，张 静，王频艺，付 明

（怀化学院生命科学系，民族药作植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化418008）

为了研究显齿蛇葡萄对食品的防腐效果，分别采摘3、7、11月份的显齿蛇葡萄叶作为实验材料，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金芽胞杆菌、藤黄八叠球菌和枯草芽胞杆菌五种微生物为实验菌株，用药敏纸片扩散法测定不同生长时期的显齿蛇葡萄叶抑菌圈直径，通过二倍稀释法测定MBC值，以平板菌落计数反映添加有不同提取物浓度的食品中微生物的生长状况。结果表明7月份采摘的显齿蛇葡萄提取物对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强，抑菌圈直径达到27.0mm，MBC为5%；当提取物浓度为4MBC时，肉汤食品抑菌时间延长达140h。显齿蛇葡萄有广谱抑菌作用，并且对猪肉、牛奶、西瓜和豆浆都有防腐作用。

显齿蛇葡萄，水提取物，药敏纸片扩散法，二倍稀释法，平板菌落计数法

显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）是葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物，主要分布于湖北、湖南、广东、江西、福建、云南、贵州等省少数民族地区，是一种民间茶用药用植物，已有上千年的应用历史[1]。根据民间长期的饮用实践和现代科学研究证实，显齿蛇葡萄具有生津止渴、甘喉润肺、护肝益血、降虚火、助消化、消炎解毒、降压减肥、润肤美容等功效[2]，这些为显齿蛇葡萄资源的开发利用提供了有价值的科学依据，也为对其进行深度开发打下良好基础。目前不少学者对显齿蛇葡萄的药理功能已进行了一系列研究[3-7]。现阶段对显齿蛇葡萄抗菌作用的研究，已取得一定成绩。但目前对不同生长时期显齿蛇葡萄抑菌效果进行比较以及测定其提取物内溶物含量的相关研究还很少。本实验运用药敏纸片法和二倍稀释法对不同生长时期的显齿蛇葡萄抑菌效果进行比较，此外做了不同提取物浓度的食品防腐研究，旨在为食品保鲜，抗生素替换物等方面提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

显齿蛇葡萄叶 于2011年4月、7月、11月采自湖南怀化康龙自然保护区；牛奶、豆浆、鲜猪肉、新鲜西瓜 均为市售；供试菌种 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CCTCCAB91053）、大肠杆菌（Escherichia coli O1）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea） 以上菌株均由怀化学院微生物学实验室提供；LB（Luria-Bertani）液体培养基 蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，用1mol/L NaOH溶液调节pH7.0，蒸馏水定容至1000mL；LB固体培养基 在LB液体培养基中加1.6%的琼脂粉。

YXQ-LS-50S1立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-2000电热恒温培养箱 天津市华北实验有限公司；CJ型水平层流净化工作台 苏州洁净技术研究所制造；SIGMA3K-18型离心机 德国SIGMA公司；RE5299旋转蒸发器 上海广英仪器有限公司；SHZD（Ⅲ）循环式真空泵 巩义市予华仪器有限公司；FD-1C冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 显齿蛇葡萄提取物的制备 显齿蛇葡萄提取物制备按照文献[8]进行改进。将显齿蛇葡萄叶洗净，于60℃恒温箱中烘干至恒重，用组织粉碎机粉碎后，称取4、7、11月叶粉末各40g，分别加入200mL蒸馏水，待煮沸后再用文火煎30min，滤出煎液，在滤渣中加100mL蒸馏水再用文火煎20min，把两次煎液混合，于4000r/min离心4min，再用旋转蒸发仪将滤液浓缩至100mL，去除沉淀，真空冷冻干燥成粉末，在干燥箱中贮藏备用。

1.2.2 菌悬液制备 菌悬液制备方法按文献[9]进行。将供试菌种分别接种在LB固体培养基上，37℃活化培养24h，挑取活化后的菌落与无菌生理盐水中混合，并用生理盐水调至0.5 McFarland单位的标准接种物，即为1×108～2×108CFU/mL的菌悬液浓度。

1.2.3 抗微生物活性实验 抗微生物活性实验按文献[10]进行改进。分别将3个样品的显齿蛇葡萄提取物粉末用蒸馏水配制成10%的浓度，再灭菌[11]。将滤纸打成直径为6mm的圆形滤纸片，灭菌、烘干后放入显齿蛇葡萄提取物中充分浸泡，取出后低温烘干，制成药敏纸片。吸取0.1mL浓度为1×108～2×108CFU/mL的菌悬液于含LB固体培养基的平板中央，将菌液均匀涂布于平板上。含菌平板倒置干燥约30min后，用镊子取药敏纸片均匀贴在平板上，每个平板贴3个药敏纸片，相对应地贴好标签。20min后，放入37℃恒温培养箱中倒置培养24h，测量抑菌圈直径。以上实验重复三次。

1.2.4 最低杀菌浓度（MBC）测定 MBC的测定按文献[12]进行改进。将显齿蛇葡萄提取物制成倍比稀释的系列试管。然后向各管中加入0.1mL浓度为1×108～2×108CFU/mL的细菌悬液，培养24h后取上述试管中0.1mL培养物涂布于LB固体培养基的平板，再置于37℃恒温培养箱中培养24h。观察培养物生长情况，没有菌生长的最低药物浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。

1.2.5 不同提取物浓度的食品制备 牛奶和豆浆加热煮沸后4℃冰箱保存备用。鲜猪肉用捣碎机捣碎成泥后，加100mL蒸馏水，用文火煮50min后取汤汁，4℃冰箱保存备用。新鲜西瓜在无菌条件下打开取汁，将上述食品配制成含7月份显齿蛇葡萄提取物的溶液，使其浓度达到0、1、2、3、4MBC，装入容器中，4℃冰箱保存备用。

1.2.6 食品防腐实验 按文献[13]进行改进。将配制好的不同浓度的提取物食品分装入大试管中，每支试管10mL，共20支试管，放入37℃恒温培养箱中培养，从0时间开始，每隔4小时取样一次，每次取0.1mL溶液涂布于LB培养基的平板中央，37℃恒温培养箱中倒置培养24h。观察细菌生长情况，并通过菌落计数法来记录细菌的生长情况。

2 结果与讨论

2.1 不同生长时期显齿蛇葡萄抑菌效果

通过三次重复的药敏纸片实验，得到显齿蛇葡萄提取物抑菌圈直径的平均值，结果如表1所示。

表1 不同生长时期显齿蛇葡萄对五种菌种的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of the extracts of A.grmsedntara in different growth stages on five bacterial strains

显齿蛇葡萄提取物对所有供试菌都显示了抗菌活性。对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强，其中7月份的显齿蛇葡萄提取物的抑菌圈直径达到27.0mm；其次是大肠杆菌；而对枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和藤黄八叠球菌抑菌活性相对较弱。三个不同生长时期的显齿蛇葡萄提取物抑菌效果最强的是7月份的显齿蛇葡萄，抑菌效果最弱的是11月份的显齿蛇葡萄。

2.2 显齿蛇葡萄最低杀菌浓度（MBC）

以7月份显齿蛇葡萄提取物配倍比系列稀释溶液，对5种供试菌种的最低杀菌浓度进行了测定，如表2所示。

表2 7月份显齿蛇葡萄提取物对5种细菌的MBC值Table 2 MBCs of the extracts of A.grossedentata which collected in July against five bacterial strains

7月份显齿蛇葡萄提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果最强，MBC为5%，对枯草芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌效果最弱，MBC为20%。

2.3 显齿蛇葡萄提取物在食品防腐中的效果

2.3.1 牛奶食品 将含有0、1、2、3、4倍MBC显齿蛇葡萄提取物的牛奶食品放置136h，定期取样进行平板涂布，观察细菌生长情况，结果见图1。

图1 显齿蛇葡萄提取物的牛奶食品抑菌曲线Fig.1 Bactericidal curves of extracts of the extracts of A.grossedentata in milk

由图1可知，含1MBC、2MBC浓度显齿蛇葡萄提取物的牛奶食品防腐效果不强，延长抑菌时间均为4h，1MBC在4～8h呈对数生长，2MBC在4～16h呈对数生长，16～32h间对数值在5.16～6.10间小幅度增加；3MBC有较好的抑菌效果，延长抑菌时间为24h，在24～72h呈对数生长；4MBC浓度的牛奶食品防腐效果最明显，可延长食品抑菌时间至80h。

2.3.2 豆浆食品 按方法2.3.1，将配制不同浓度的显齿蛇葡萄提取物的豆浆食品放置114h，定期取样进行平板涂布，观察细菌生长情况，结果见图2。

图2 显齿蛇葡萄提取物的豆浆食品抑菌曲线Fig.2 Bactericidal curves of extracts of the extracts of A.grossedentata in soy milk

不同提取物浓度的豆浆食品防腐效果不同。其中1MBC、2MBC浓度的豆浆食品效果接近，均可延长食品抑菌时间4h，但2MBC对数值的增长速率较1MBC小；3MBC有一定的抑菌效果，延长食品抑菌时间12h，在12～40h细菌生长的对数图成抛物线，对数值的增长速率逐渐减小；4MBC浓度的豆浆食品可延长食品抑菌时间48h，在48～90h细菌呈对数生长，其对数值的增长速率最小。

2.3.3 西瓜食品 按方法2.3.1，将配制不同浓度的显齿蛇葡萄提取物的西瓜食品放置94h，定期取样进行平板涂布，观察细菌生长情况，结果见图3。

图3 显齿蛇葡萄提取物的西瓜食品抑菌曲线Fig.3 Bactericidal curves of extracts of the extracts of A.grossedentata in watermelon

其中1MBC浓度的西瓜食品没有明显的抑菌效果，基本上不能延长抑菌时间；2MBC和3MBC浓度的西瓜食品防腐效果较明显，分别延长食品抑菌时间约8h、12h，在12～32h间3MBC的细菌生长对数曲线呈抛物状，细菌生长的对数值增加速率逐渐减慢；4MBC抑菌效果最好，延长抑菌时间可达64h，在64～72h呈对数增长，其对数值的增长速率最小。

2.3.4 肉汤食品 按方法2.3.1，将配制不同浓度的显齿蛇葡萄提取物的肉汤食品放置180h，定期取样进行平板涂布，观察细菌生长情况，结果见图4。

图4 显齿蛇葡萄提取物的肉汤食品抑菌曲线Fig.4 Bactericidal curves of extracts of the extracts of A.grossedentata in pork

1MBC浓度的肉汤食品有一定抑菌效果，能延长抑菌时间至12h，在12～20h内细菌生长对数值呈直线增长；2MBC和3MBC的抑菌效果差异不显著，延长抑菌时间均为16h左右，2MBC浓度的食品细菌生长对数值呈抛物线增长，比1MBC的对数值增长速率大，3MBC比2MBC的对数值增长速率小，在20～32h间对数值在2.97幅度间增加；4MBC浓度的肉汤食品防腐效果最强，可延长食品抑菌时间至140h。

3 结论与讨论

长期以来，在食品工业中都习惯于使用化学合成品作为食品防腐剂，如苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类和对羟基苯甲酸酯类等，但这些化学合成的食品防腐剂在使用过程中或多或少地会对食品的风味产生一定的不良影响；更重要的是这些防腐剂在食品加工中的添加量都比较大，容易超标使用而对人体产生毒副作用。近年来天然防腐剂的研究和开发利用成为了食品工业的一个热点。本文研究结果表明，显齿蛇葡萄对牛奶、豆浆、西瓜、肉汤等常见食品有不同程度的抑菌作用，当提取物浓度达到4MBC对牛奶、肉汤的杀菌作用可以分别达到80和140h，抑菌效果十分明显，表明显齿蛇葡萄是一种有开发潜力的天然防腐剂。显齿蛇葡萄显齿蛇葡萄能作为添加剂应用到食品中的有效成分活性非常高，提取工艺简单，成本低，且价值化技术日渐成熟，随着研究的不断深入，显齿蛇葡萄及其提取物在食品防腐和制药原料将有广阔的应用前景。但由于显齿蛇葡萄提取物颜色较深，对风味也有一定的影响，添入食品中会影响食品的色、香、味，因此，要将显齿蛇葡萄开发成新的天然食品防腐剂，还需要进一步研究其有效成分的提取和加工。

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Application on food preservation of Ampelopsis grossedentata leaves

LIU Sheng-gui，ZHANG Jing，WANG Pin-yi，FU Ming
（The Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of HUnan Province，Department of Life Sciences，Huaihua University，Huaihua 418008，China）

To research the application on food preservation of extract of Ampelopsis grossedntata，the leaves of A.grossedentata that were collected in March，July and November were taken as experimental materials，respectively.Escheridhia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus thuringiensis，Sarcina lutea and Bacillus subtilis were taken as experimental strains.After the different bacteria were dealed with leaves extracts of A. grmsedntara，the inhibitory zone diameters were evaluated by using a disk-diffusion and the minimum bactericidal concentrations（MBC）were detected by double dilution method during the process of bacterial growth.Microorganisms in the food solution，which were related to different concentrations of the extracts，were quantified by colony counting method.The results showed the extracts from the leaves of A.grossedentata were collected in July had the strongestantibacterial effect on S.aureus，the inhibitory zone diameter reached 27.0mm and MBC was only 5%.Bacteriostatic time for broth food could reach 140h when the concentration of the extracts was 4MBC.This indicated the extracts from the leaves of A.grossedentata had broad antimicrobial spectrum and good preservative effect on pork，milk，watermelon and soy milk.

Ampelopsis grossedentata；water extracts；drug sensitive slips method；double dilution method；plate culture count method

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0118-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.017

2013－08－14

刘胜贵（1965-），男，硕士研究生，主要从事食品微生物学教学与研究方面的工作。

湖南省教育厅科研项目（11C0988）；湖南省重点学科建设项目资助。