高效液相色谱法测定芡实中不同构型维生素E的含量

王 红，吴启南，伍城颖，贺潇潇，吴达维，谷 巍，乐 巍

（南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

高效液相色谱法测定芡实中不同构型维生素E的含量

王 红，吴启南*，伍城颖，贺潇潇，吴达维，谷 巍，乐 巍

（南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

目的：建立了芡实中不同构型维生素E的RP-HPLC含量测定方法。方法：采用高效液相色谱分析，Waters XBridge C18柱（4.6mm×150mm，5μm），以A相甲醇和B相水（97∶3）为流动相等度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温：30℃，检测波长为295nm。结果：α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚均能够达到基线分离，α-生育酚在0.12～1.2g/L范围内具有良好的线性关系，R21=0.9998；β+γ-生育酚在0.056～0.56g/L范围内具有良好的线性关系，R22=0.9999；δ-生育酚则在0.0096～0.096g/L范围内具有良好的线性关系，R23=0.9998。平均加样回收率分别为100.47%，100.04%，99.10%；RSD分别为0.27%，4.65%，1.92%。安徽安庆芡实中总VE含量最高，可达2.2633mg/g。结论：该方法简便、准确、重现性好，为芡实药材的质量评价提供合理的参考依据。

芡实，高效液相色谱法，维生素E

芡实（Euryale Semen）为睡莲科芡属一年生水生草本植物芡（Euryale ferox Salisb.）的干燥成熟种仁，又名鸡头米、鸡头莲，素有“水中人参”的美誉。为药食两用中药，历版药典均有记载。其味甘、涩，性平，具有养血安神、益肾固精、补脾止泻、祛湿止带的功效[1]。营养价值较高，含有丰富的蛋白质、氨基酸[2]、矿物质、不饱和脂肪酸、维生素、粗纤维等多种营养性成分[3]。但芡实的中医功效物质基础始终未能明确。

维生素E又称生育酚（tocopherol）或抗不育维生素，是一种脂溶性的维生素，金黄色或淡黄色粘稠油状物，易溶于脂肪和乙醇等有机溶剂，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感。在医药领域，作为细胞内的抗氧化剂，在促进性激素分泌、增强免疫功能、保护红细胞、对抗自由基氧化、抑制诱变剂的形成、修复生物膜和DNA等中扮演着重要的角色，临床上可用于治疗老年性痴呆病、高血压、冠心病、心肌梗塞、动脉硬化、血栓、不孕症等[4]，是人体不可或缺的维生素之一，也是芡实的中医功效物质基础之一。因此，开展芡实中维生素E的含量测定研究，对芡实质量评价，提升药材质量标准均具有十分重要的意义。

维生素E，包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，即α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-三烯生育酚，其中α-生育酚是自然界分布最为广泛含量最为丰富活性最高的维生素E形式，β、γ、δ-生育酚的活性分别是α-生育酚的50%、10%和3%，α-三烯生育酚约为30%，而其他三烯酚约为10%左右[5]。无论在营养、生理活性还是在安全性上天然维生素E均优于合成的维生素E。

以下是α、β、γ、δ-生育酚同族异构体。化学结构式如下：

图1 维生素E结构式Fig.1 Structure of Vitamin E

关于芡实中维生素E含量测定国内外还未有报道，本实验拟通过改进样品制备方法，采用高效液相色谱技术，建立芡实中不同构型维生素E含量的测定方法，为芡实的质量评价和综合利用提供合理的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芡实 来源于全国15个产地，经南京中医药大学药学院吴启南教授鉴定为睡莲科植物芡Euryale ferox Salisb的干燥成熟种仁，具体产地见表1；维生素E标准品 美国Sigma公司；甲醇 色谱纯，江苏汉邦科技有限公司，批号：131583；无水乙醇 分析纯，南京化学试剂有限公司，批号：130512；石油醚 分析纯，无锡市亚盛化工有限公司，批号：130107；氢氧化钾 分析纯，阿拉丁试剂有限公司，批号：131058；抗坏血酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20100108；无水硫酸钠 分析纯，南京化学试剂有限公司，批号：120511；自制超纯水。

Waters 2695型高效液相色谱仪（高精度四元梯度泵、自动进样器），Waters 2998 PDA检测器，Empower色谱工作站，Waters XBridge C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm） Waters；KH300SP型超声波提取设备（配有25KHz、40KHz双频，功率300W） 昆山禾创超声仪器有限公司；B-490 BUCHI Rotavapor R-205型旋转蒸发仪 瑞士步琪有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；BT125型电子天平塞多利斯科学仪器有限公司；SAGA-10TY型实验室级超纯水器 南京易普易达科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液制备 精密称取样品约2g，过80目筛，置于100mL具塞锥形瓶中，依次加入60mL的无水乙醇，10mL抗坏血酸，超声提取（频率25kHz，功率240W）[7]，提取3次，1h/次，合并提取液，过滤入球形蒸发瓶，用50mL无水乙醇分3次冲洗锥形瓶及残渣，并入球形蒸发瓶，于旋转蒸发仪减压回收溶剂至干，用色谱甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）过滤，即得。

1.2.2 高效液相色谱条件 色谱柱：Waters XBridge C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相为V（甲醇）∶V（水）=97∶3，检测波长295nm。柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL。

1.2.3 标准溶液的配制 分别精密称取12、5.6、0.96mg的α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚标准品（因β-生育酚和γ-生育酚在此色谱条件较难分离，故使用β-生育酚代替γ生育酚的定量，测定两者的总含量）[6]，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚浓度分别为1.2、0.56、0.096mg/mL的标准品母液。

表1 芡实样品来源Table 1 Sources of euryales semen

1.3 数据的分析

利用SPSS 19.0统计软件，计算不同产地芡实的维生素E含量，采用平均距离法进行聚类分析，对不同产地芡实中的α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚及总维生素E含量进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

因α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚在295nm处有最大吸收峰，流动相为甲醇和水（97∶3），流速为1mL/min时能够快速有效地分离α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚，其保留时间分别为6.827、8.033、9.204min，具体分析图谱见图3。样品中，各目标峰与其他杂质峰分离良好。

2.2 维生素E提取优化

国标法[8]中VE的含量测定方法为HPLC法，但样品的前处理方法回流皂化法操作较为繁琐。实验根据样品中脂溶性成分含量较少的特点，分别考察了回流、索氏、超声3种提取方法，石油醚、无水乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮6种提取溶剂对VE含量测定的影响（见图2），结果表明无水乙醇超声提取效率高、省时、方便、快捷。

在此基础之上，对超声功率、提取时间、提取次数、粉碎粒度进行优化，结果表明在超声功率240W、提取时间为1h，提取次数3次、粉碎粒度为80目的情况下，VE提取较为完全。具体结果见图2。

2.3 线性关系的考察实验

分别精密吸取上述α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚标准品母液100、200、500、800μL至1mL容量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，进样10μL，以色谱峰面积（Y）对浓度（X）进行回归，得α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚的线性回归方程见表2。

表2 线性方程及参数Table 2 Linear equations and parameters

图2 维生素E提取优化Fig.2 Optimization of extraction of vitamin E

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 精密吸取α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚标准品混合溶液10μL，按1.2.2项所述色谱条件下重复进样6次，测得α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚的峰面积RSD分别为1.69%、2.42%、2.79%，表明仪器进样精密度良好。

2.4.2 稳定性实验 取1.2.1供试品溶液10μL，按1.2.2项所述色谱条件，分别在0、1、2、4、8、12、16、24h进样，测定α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚的峰面积的RSD分别为2.23%、2.97%、1.84%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.4.3 重现性实验 取同一产地芡实样品，按1.2.1供试品制备方法配制6份，在1.2.2项所述色谱条件下，分别进样10μL，测定α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚含量的RSD分别为1.38%、0.92%、3.61%，表明该方法的重现性良好。

2.4.4 加回收率实验 精密称取已知维生素E含量的样品9份，分为3组，分别依次加入α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚标准品1.0094、0.5231、0.1820mg，按1.2.1供试品制备方法制备样品溶液，进样10μL，进行测定，按下式计算回收率：回收率（%）=（测定VE量-样品原VE量）/添加VE量×100，结果见表3。

2.5 样品含量测定

按1.2.1供试品制备方法，制成不同产地样品溶液10mL，平行进样3次，每次10μL，测定峰面积，由线性方程计算得VE含量见表4，标准品及供试品色谱图见图3。

表3 回收率实验结果（n=3）Table 3 Recovery results（n=3）

表4 不同产地芡实中不同构型VE含量测定结果Table 4 Result of determination of different configuration of vitamin E from 15 habitats

2.6 维E含量聚类分析

以α-生育酚、β+γ-生育酚、δ-生育酚及总维生素E含量测定结果为聚类分析，采用平均距离法进行聚类分析，得到聚类树状图，如图4所示。

图3 VE标准品及样品的HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms of vitamin E from standard and sample

图4 不同产地芡实维生素E含量测定结果聚类树状图Fig.4 Cluster analysis dendrogram based on determination of vitamin E from 15 habits

由图4可知，按照维生素E含量的高低，15个产地芡实样品可以分为3大类。其中3、11、6、10共4份样品聚为一类，代表维生素E含量最高组，均分布于我国的华东及中南地区；1、2、4、5、8、9、13、14共8份样品聚为一类，代表维生素E含量较高组，均分布于我国的西南及华东地区；7、12、15共3份样品聚为一类，代表维生素E的含量较低组，由此可以看出，不同产地芡实中维生素E含量差别较大。

3 结论

本研究中维生素E含量测定结果显示，除山东枣庄中的δ-生育酚含量较β+γ-生育酚含量高以外，其他各产地芡实中VE含量均符合α-生育酚＞β+γ-生育酚＞δ-生育酚的规律。总VE含量，以S10（安徽安庆）含量最高（2.2633mg/g），S15（扬州宝应）含量最低（1.3148mg/g）；α-生育酚含量，以安徽安庆含量最高（1.6889mg/g），扬州宝应含量最低（0.7079mg/g）；β+ γ-生育酚含量，以四川成都含量最高（0.6572mg/g），S12（广西桂林）含量最低（0.3133mg/g）；δ-生育酚含量，以S9（山东枣庄）含量最高（0.3745mg/g），广西桂林含量最低（0.1146mg/g）。本文为临床芡实的使用提供了合理的依据。

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Determination of different configuration of vitamin E in Euryale Semen by HPLC

WANG Hong，WU Qi-nan*，WU Cheng-ying，HE Xiao-xiao，WU Da-Wei，GU Wei，YUE Wei
（College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Objective：A reversed-phase high performance liquid chromatographic method（RP-HPLC）was developed for determination of different configuration of vitamin E in Euryale Semen.Methods：RP-HPLC determination was performed on a Waters Xbridge C18column（4.6mm×150mm，5μm），Methanol-water（97∶3）was used as the mobile phase at the flow rate of 1.00mL/min，the column temperature was kept as 30℃ and the detection wavelength was set as 295nm.Results：α-tocopherol，β+γ-tocopherol，δ-tocopherol were separated in baseline，the linear range was 0.12～1.2g/L for α-tocopherol，0.056～0.56g/L for β+γ-tocopherol and 0.0096～0.096g/L for δ-tocopherol.R2were 0.9998，0.9999，0.9998，the average recoveries were 100.47%，100.04%，99.10%.RSD were 0.27%，4.65%，1.92%.The total Vitamin E content of the sample of Anhui was the highest with 2.2633mg/g.Conclusion：This method was sample，accurate and with good reproducibility，which could be used as Euryale Semen quality control of medicine and also provides a scientific reference for the rational use of Euryale Semen.

Euryale Semen；HPLC；vitamin E

TS207.3

A

1002-0306（2014）08-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.007

2013－09－13 *通讯联系人

王红（1989-），女，硕士研究生，研究方向：中药品质评价。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAI04B06）；江苏省优秀科技创新团队“中药资源化学”（2011）。